發酵液中分離多粘菌素E的生產工藝研究

馬文艷 潘忠成 王衛富 翁婧 李蒲民

摘要：主要研究了沉淀法分離提取發酵液中多粘菌素E（Colistin sulfate）的生產工藝。對超濾液熱絮凝、吸附脫色、堿性沉淀以及濃縮液二次脫色等工藝參數進行了考察，結果表明：工藝最佳條件：超濾液90～95℃熱絮凝5min后，板換快速冷卻，復合脫色處理：加碳量0.1%、亞硫酸鹽0.5%～1.0%，沉淀條件：pH值為11.0～12.5、15～30℃、靜置1h，濃縮液脫色添加0.4%～0.8%活性炭，處理0.5h，最高收率達到90%以上，成品各項指標符合EP生產標準。通過連續穩定性試驗對各個參數進行驗證，得到了適用于工業化生產的多粘菌素E分離工藝。

關鍵詞：硫酸粘桿菌素;沉淀分離法;堿性多膚;絮凝

中圖分類號：TQ923 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）22-0186-04

1 引言

多粘菌素E是一種堿性多肽類抗生素，獸用硫酸粘菌素商品為其硫酸鹽。目前生產中主要是連續樹脂法分離提取[1，3]，但此法污水量大，工藝復雜，收率低。文獻報道中的對多粘菌素E分離技術較多[2，4，5]，但都不能形成可行性的生產工藝。活性炭是一種傳統的脫色劑，其生產工藝簡單，可操作性強，效率高，是抗生素生產提取工藝常見脫色方法。沉淀法分離抗生素是一種傳統方法，具有操作簡單，但由于多粘菌素的堿性不穩定性[5，6]，收率不穩定，尚無利用此法的生產報道。作者在前期研究在堿性沉淀法[8]上做了大量基礎工作，本文通過對利用傳統的活性炭預處理和堿性沉淀法分離多粘菌素E進行研究，優化各項工藝操作參數，并與膜分離[2]等工藝結合，獲得了能夠替代樹脂法的多粘菌素E生產工藝。

2 材料與方法

2.1 材料

多粘菌素E標品（BR）由天津施瑞克公司提供，硫酸及硫酸鹽等其他試劑為國產分析純，活性炭為福建大林森木質活性炭。

2.2 實驗方法

（1）多粘菌素E測定高效液相色譜法（HPLC），文獻[9]改進方法。

（2）蛋白相對含量測定方法采用紫外分光光度計，設定波長280nm，物料稀釋50～100倍測定吸光值。

（3）色素相對含量測定方法采用可見分光光度計，設定波長400nm測定吸光值。

3 結果與分析

3.1 多粘菌素E超濾液預處理

3.1.1 熱處理

對超濾液進行熱處理（結果見圖1），試驗過程中，加熱溫度80℃以上時，蛋白絮凝量逐漸增多，色素量降低，當溫度高于90℃左右出現拐點，色素去除率下降，蛋白去除率升高減緩，同時降解率快速升高。

結果表明：溫度在90℃左右最佳，可除去較多的雜質，收率保持在95%以上，褐變反應加快。因此，熱處理過程應快速升溫及降溫，盡量縮短溫度對效價和褐變反應的影響。

3.1.2 脫色處理

陶瓷清液90～95℃熱處理，活性炭和還原劑復合影響效果明顯（圖2），色素去除率與還原劑量呈正相關，蛋白去除率與之無關，當還原劑量超過1%，對收率產生負影響。結果表明，亞硫酸鹽對褐變反應速率抑制及還原性脫色有較好影響，但過量鹽加入，可能影響多粘菌素E的電荷狀態或構象，穩定性降低導致降解發生。

活性炭對熱處理后濾液的脫色效果（圖3），活性炭加入量和雜質去除率、效價損失率呈正相關。結果表明：較少的活性炭對效價也有明顯的影響，但其脫色及去蛋白效果又很顯著，因此保證收率的前提下0.1%的炭量處理為最佳。

3.2 多粘菌素E堿性沉淀過程

3.2.1 不同條件對多粘菌素E穩定性的影響

前期的試驗數據和藥典記錄一致，堿性條件下，尤其是溶液或濕晶體狀態下，硫酸粘桿菌素降解受pH值、溫度、時間等因素影響明顯。

堿性pH值條件下，多粘菌素E的穩定性較差，沉淀絮凝和降解反應同時發生。pH值和溫度對穩定性的影響（見圖4，圖5），結果表明：pH值低于11.5的時理論降解率反而更高，pH值在11.5～12.0，沉降過程的理論降解率較低。結果說明，pH值和溫度都偏低時，多粘菌素E多呈溶解短膚，更易降解;而pH值和溫度過高，直接導致堿性降解反應速率加快。

這與試驗過程觀測到的情況一致，條件前期多粘菌素的形成絮凝速率和降解率呈負相關，而調堿后期，尤其是較高溫度，絮凝沉淀快速形成，降解率反而降低。多粘菌素E呈游離短肽時，更易降解，降解量的累計和時間呈正相關（圖6）。結果表明：在試驗過程，調堿操作時間越短，降解率越低，0.5～1h的生產操作時間可以降理論降解率控制在10%以內。

3.2.2 不同條件對多粘菌素E沉淀收率的影響

pH值和溫度對沉降收率的影響（見圖7，圖8），結果表明：pH值在11.5左右，溫度在25℃左右，沉降收率分別達到最高。

沉降時間對收率的影響（見圖9），結果表明：沉降時間在1h左右，收率達到最高85%～86%。而在保護劑的作用下（見圖10），0.1%～0.2%的還原性保護劑可以和環境中的氧化性基團作用，提高活性短肽的惰性，收率提高到88%～89%。

3.2.3 不同條件對多粘菌素E濃縮液脫色處理效果的影響

超濾液在pH值為4.0時，不同活性炭量的脫色結果（見圖11），色素的去除率同活性炭量呈正相關，少量活性炭對色素的吸附效率較高，過量加入活性炭的色素吸附效率明顯下降;脫色時間的色素去除率的影響較小，但炭加入過多，脫色時間較長，對效價損失影響明顯，脫色時間控制在0.5h左右最適。

采用0.6%活性炭脫色，考察pH值對活性炭的脫色效果影響（見圖11）。結果表明：相對較高的pH有利于色素的去除，但效價損失率也較高。結果可見，pH值為4.0左右色素去除率較高，同時效價損失率明顯降低。

氧化劑脫色與活性炭的復合脫色作用結果（圖12），復合處理比活性炭單獨處理色素去除率提高15%左右，氧化劑與有機物活性基團的反應能力較強，極易對效價產生影響，使用量不宜過多。

不同活性炭量對復合脫色效果的影響（見圖13），結果表明，活性炭量對復合處理色素去除率影響較小，但對效價損失影響較大。

不同濃度濃縮液對復合處理的脫色影響（見圖14），結果表明，濃縮液效價在400～800萬單位之間，效價高低和脫色效果呈負相關。這說明高效價濃縮液粘度較大，脫色過程色素與活性炭的表面接觸幾率降低，同時多粘菌素E被活性炭吸附后，活性炭的吸附能力進一步降低。

3.3 工藝穩定性試驗

采用以上試驗最佳結果進行多批試驗，同時對脫色后濃縮液進行高溫噴干形成成品。對試驗各步收率進行統計以及成品各項指標結果（見表1，表2）。

連續進行多批工藝穩定性驗證，總收率收率和干粉指標都達到預期目標，工藝各階段質量控制穩定。

4 結論

（1）工藝最佳條件：超濾液90～95℃熱絮凝5～10min后，冷卻過濾，一次脫色加碳量0.1%、亞硫酸鹽0.5%～1.0%，沉淀條件pH值為11.0～12.5、15～25℃、靜置1h，濃縮液添加0.4%～0.8%活性炭脫色0.5～1h，最高收率達到90%以上。

（2）少量的亞硫酸鹽類保護劑和活性炭的復合處理效果明顯，但生產應用還有待進一步生產驗證。

（3）脫色后噴干成品各項指標達到EP標準，通過試驗連續驗證，該工藝流程簡單，完全可以達到生產要求。

參考文獻：

[1]顧覺奮，寇曉康，杜振寧，等.離子交換與樹脂吸附在制藥工業上的應用[M].北京：中國醫藥科技出版社，2008.3

[2]楊亞勇，劉珍奇，蔣順進.超濾膜在多粘菌素E預處理中的應用[J].中國抗生素雜志，2001（4）：244～245.

[3]邢維玲，周希貴，王賀祥，等.離子交換層析法提取黏桿菌素的研究[J].中國獸醫雜志，2002（11）：44～46.

[4]佟斌，劉桂敏，吳兆亮，等.泡沫分離提取多粘菌素E的工藝研究[J].食品工業科技，2007，28（5）：153～155

[5]孟杰，劉桂敏，趙艷麗，等.硫酸多黏菌素E水溶液的表面張力和泡沫性能的研究[J].中國抗生素雜志，2007，32（11）：696～672.

[6]常曉菲，王宏，王靜.硫酸多粘菌素B提取工藝的研究進展[J].北方藥學，2011（10）：13～14.

[7]馬衛明，佘銳萍，彭芳珍，等.肽類抗生素研究進展[J].中國獸醫雜志，2005，6（41）：38～41.

[8]丁緒芹，張勁松，王福嶺.沉淀法分離硫酸粘桿菌素工藝研究[J].中國獸藥雜志，2013，47（6）：27～30.

[9]解慶鎮，顧吉林.多粘菌素E的高效液相色譜測定[J].中國抗生素雜志，1988（13）：36～40.

收稿日期：2019-10-09

基金項目：陜西省科技項目（編號：2018ZKC-173;2019-PT-15）;渭南市科技局項目（編號：ZDYF-SFGG-17-ZSG）

作者簡介：馬文艷（1981-），女，碩士，主要從事應用微生物及生物醫藥方面的工作。

通訊作者：潘忠成（1974-），男，博士，主要從事應用微生物及生物醫藥方面的工作。