三金合八正散與諾氟沙星對濕熱型石淋大鼠的療效分析※

李坤瑜,崔向青,文 超,盧天戈,符馨文,李凱旋,劉 慧,吳 珺,馬 鑫,楊向竹

(北京中醫藥大學,北京100029)

研究表明,感染性結石占泌尿系結石的2%～20%[1]。中醫認為,感染性尿路結石屬于濕熱型“石淋”范疇。基于中醫傳統理論及現代中藥藥理學研究,現代中醫臨床多以八正散為基礎方加減治療本病,并取得良好的臨床療效[2]。八正散出自《太平惠民和劑局方》,輔以三金(金錢草、海金沙、雞內金),諸藥合用共奏清熱瀉火、利水通淋化石之功。諾氟沙星是第2代喹諾酮類抗菌藥,具有抗菌譜廣、作用強、不良反應少等優點,對變形菌屬在體外具有良好的抗菌作用。臨床上,結石直徑較小時可以考慮選擇敏感性抗生素如喹諾酮類等,并配合運動、飲食治療。本研究通過建立濕熱型石淋大鼠模型,從尿液p H值變化、泌尿系統超聲影像及結石重量等方面,比較三金合八正散、諾氟沙星及聯合用藥對濕熱型石淋大鼠的療效,現報道如下。

1 材料

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠70只,體質量(180±10)g,由斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司提供[許可證號：SCXK(京)2011-0004],大鼠均在北京中醫藥大學基礎醫學院動物中心清潔級動物室飼養,可以自由獲取食物及飲水,室溫(20±2)℃,濕度50%～60%。

1.2 菌株 奇異變形桿菌CMCC(B)-49005由中國藥品生物制品檢定所醫學菌種保藏中心提供。

1.3 儀器及試劑 高分辨率超聲影像設備,加拿大Vevo-TM-2100。三金合八正散配方顆粒由北京康仁堂藥業有限公司提供;諾氟沙星膠囊由石藥集團歐意藥業有限公司提供(國藥準字H13022807);水合氯醛由青島宇龍海藻有限公司提供(國藥準字H37022673)。

2 方法

2.1 分組與造模 70只大鼠適應性飼養5 d后開始分組造模。實驗大鼠隨機分為空白組,模型組,西藥組,中西藥聯合組,中藥高、中、低劑量組,共7組,每組10只。菌液及異物制備：在血瓊脂平板上孵育奇異變形桿菌24 h后,從血瓊脂平板上挑出單個菌落,用5 m L生理鹽水制成懸液。在充足光線下,背對著有白色背景與黑色對比線條的卡片,將接種管與0.5號麥氏標準管進行目測比較,將菌懸液調至0.5麥氏濁度。此時菌懸液內含培養物(1～2)×108CFU/m L。再將菌懸液用0.9%氯化鈉注射液進行1︰10稀釋,獲得107CFU/m L菌懸液。另取聚乙烯管(長4 mm,直徑0.5 mm),浸泡于107CFU/m L的菌懸液中,置于37℃恒溫箱中培養8 h以上。手術操作：空白組,10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射麻醉,腹部備皮后以1.5%碘伏消毒,鋪無菌手術巾。麻醉滿意后取恥骨弓上方下腹部正中切口,切開腹腔,提起膀胱,使用無菌G18穿刺針,于膀胱頂部穿刺入膀胱后直接退出,膀胱內不置異物,關閉腹腔,手術6 h后恢復進食、進水。模型組、西藥組、中西藥聯合組、中藥組,建立濕熱型石淋大鼠模型。麻醉、消毒、切口、穿刺方法同空白組,使用無菌G18穿刺針,于膀胱頂部穿刺入膀胱,經穿刺針內腔,用推桿將聚乙烯管(此前于107CFU/m L的細菌懸液中培養8 h以上)推入膀胱,退出穿刺針后關閉腹腔,手術6 h后恢復進食、進水。以上各組大鼠白天均喂食充足的飼料,自由飲水[3]。

2.2 給藥 手術后第14日開始灌胃給藥,連續每日給藥14 d。空白組、模型組給予生理鹽水(與藥物等體積)。西藥組給予諾氟沙星7.27 mg/100 g。中西藥聯合組給予諾氟沙星7.27 mg/100 g和中劑量中藥。中藥高劑量組給予三金合八正散配方顆粒,相當于原生藥：瞿麥272 mg/100 g、萹蓄218 mg/100 g、滑石454 mg/100 g、車前子363 mg/100 g、梔子327 mg/100 g、大黃236 mg/100 g、川木通109 mg/100 g、燈心草54 mg/100 g、炙甘草109 mg/100 g、金錢草545 mg/100 g、海金沙545 mg/100 g、雞內金545 mg/100 g。中藥中劑量組給藥量為高劑量組的1/2,中藥低劑量組給藥量為高劑量組的1/4。

2.3 檢測指標及方法 ①于手術前、治療前、治療完成時對各組大鼠進行超聲影像檢查。以10%水合氯醛麻醉大鼠后,大鼠下腹部及側腹部備皮,用高分辨率超聲影像設備采集各組大鼠腎臟、膀胱超聲影像。②從手術后第2日到第26日,每3 d用掐鼠尾取尿法收集各組大鼠尿液,并用精密p H試紙測定各組大鼠尿液p H值。③于手術后第28日用10%水合氯醛以過量麻醉法處死各組大鼠,打開大鼠腹腔,分離出膀胱、輸尿管、腎臟組織,獲取各組大鼠的尿路結石并稱重。

2.4 統計學方法 采用SPSS 21.0統計學軟件分析數據。計量資料以均數±標準差s)表示,多組間總體比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

(1)動物死亡情況 實驗過程中,大鼠總計死亡10只,其中模型組3只,中藥中劑量組1只,中藥高劑量組3只,中西藥聯合組1只,西藥組1只,空白組1只。空白組大鼠死于食道穿孔,其余各組大鼠均死于腹腔重癥感染。

(2)超聲影像檢查 空白組大鼠：充盈的膀胱形態不規則,腔內呈均勻的無回聲區,膀胱壁為完整光滑的帶狀強回聲;腎臟形態正常,呈扁豆形,外緣隆凸,內側腎門凹陷,腎包膜呈帶狀強回聲。模型組大鼠：充盈的膀胱形態不規則,腔內有弧形帶狀強回聲,伴聲影,膀胱壁增厚不光滑;腎臟明顯增大,腎門處強回聲,伴帶狀聲影,腎盂部回聲增強。西藥組大鼠：充盈的膀胱形態不規則,腔內有點狀強回聲,膀胱壁增厚不光滑;腎臟體積未見明顯改變,腎盂部低回聲。中西藥聯合組及中藥高課題組、中藥中劑量組大鼠：充盈的膀胱形態不規則,腔內未見明顯回聲,膀胱壁增厚不光滑;腎臟體積未見明顯改變,腎盂部呈低回聲。中藥低劑量組大鼠：充盈的膀胱形態不規則,腔內呈均勻的弱回聲區,膀胱壁增厚不光滑;腎臟體積未見明顯改變,腎盂部低回聲。圖1、圖2見本期第109頁。

(3)尿液p H值 空白組大鼠行假手術,其尿液p H值維持正常。模型組大鼠術后尿液p H值持續上升,其尿液呈堿性。西藥組,中西藥聯合組及中藥高、中、低劑量組大鼠尿液p H值給藥前呈現先平穩后上升的趨勢。給藥后,西藥組大鼠尿液p H值先下降至正常值,17 d后持續上升呈弱堿性。中藥低劑量組在17 d前有先下降后上升的趨勢,隨后呈現下降趨勢。中西藥聯合組及中藥高、中劑量組大鼠尿液p H值持續下降,并呈酸性。其中,中藥低劑量組尿液p H值下降幅度最小,中西藥聯合及中藥高、中劑量組大鼠尿液p H值下降幅度基本相同。圖3見本期第109頁。

(4)大鼠結石重量比較 模型組與空白組比較,差異有統計學意義(P＜0.01)。西藥組、中西藥聯合組及中藥高、中、低劑量組結石重量與模型組比較,差異均有統計學意義(P＜0.01)。其中西藥組、中西藥聯合組及中藥中劑量組大鼠結石重量比較,差異均無統計學意義(P＞0.05);中藥高劑量組與西藥組、中西藥聯合組、中藥中劑量組、中藥低劑量組大鼠結石重量比較,差異均有統計學意義(P＜0.01)。見表1。

表1 各組濕熱型石淋大鼠治療后結石重量比較(mgs)

表1 各組濕熱型石淋大鼠治療后結石重量比較(mgs)

注：與空白組比較,△△P＜0.01;與模型組比較,▲▲P＜0.01

組別 只數 結石重量空白組 9 0模型組 7 38±16△△西藥組 9 10±4▲▲中西藥聯合組 9 16±4▲▲中藥低劑量組 10 23±5▲▲中藥中劑量組 9 13±7▲▲中藥高劑量組 7 0▲▲

4 討論

感染性尿路結石形成機制是泌尿系統被產生尿素酶的細菌感染,細菌將尿素分解為氨和二氧化碳,氨水合成氫氧化銨,增加尿液p H值,銨與尿液中的鎂和磷酸根結合成磷酸鎂銨,濃度過度飽和而析出。同時,在堿性條件下,尿中鈣和磷酸根化合形成磷灰石析出,并與尿素產生的二氧化碳結合形成碳酸磷灰石,從而形成感染性結石。細菌、感染產物及壞死組織亦為形成結石之核心[4]。臨床內科治療本病以酸化尿液、控制感染及解痙止痛為目標,藥物多選用氯化銨酸化尿液,敏感性抗生素如頭孢菌素、喹諾酮類及復方新諾明等控制尿路感染,對于結石嵌頓引起平滑肌痙攣導致疼痛者配合使用α1受體阻滯劑,如萘哌地爾[5]。但長期使用氯化銨會增加尿液氨的排泄,從而抵消其酸化作用[4]。長期使用抗生素會導致體內細菌耐藥或菌群失調。外科治療本病多選擇體外沖擊波碎石術(ESWL),開放性手術也有應用。但ESWL和開放性手術皆有術后殘余結石、結石易復發的缺點。

中醫治療濕熱型石淋積累了豐富的理論和臨床經驗。《丹溪心法》曰：“諸淋所發,皆腎虛而膀胱生熱也。”現代中醫將本病的病因病機歸納為濕熱蘊結、腎氣不足、氣滯血瘀,其中濕熱蘊結下焦為本病的主要病機,貫穿全程。基于中醫傳統理論及現代中藥藥理學研究,臨床多以三金合八正散為基礎方加減治療本病,并取得較好的效果。八正散由車前子、瞿麥、扁蓄、滑石、山梔子、炙甘草、木通、大黃組成,方中瞿麥、萹蓄味苦性寒,善清利膀胱濕熱,有利小便、祛淋濁、通癃閉之功效;木通清心利小腸,車前子清肺利膀胱,滑石清利三焦、通淋利竅,共助清熱利水之力;梔子清利三焦濕熱,大黃泄熱降火利濕,兩藥相伍,引濕熱從二便出;燈心草清熱除煩,炙甘草調和諸藥,制苦寒滲利太過,緩急止痛。輔以金錢草、海金沙、雞內金。現代藥理學研究表明,金錢草中含有的黃酮類化合物,其羰基及酚羥基可以與尿液中的鈣離子產生絡合作用,降低鈣離子濃度,防止草酸鈣過度飽和,抑制草酸鈣晶體生長,從而抑制泌尿系結石的形成和增長[6]。同時,金錢草還有增強輸尿管蠕動、增加尿量及抗炎抑菌退熱等作用,可降低尿液p H值[7]。海金沙能促進輸尿管蠕動,使輸尿管上端的壓力明顯增加,還有抗菌、抗炎、鎮痛的作用[8]。雞內金有加強膀胱括約肌收縮的作用,促進砂石排出[9]。全方相合,共奏清熱瀉火、利水通淋化石之功。

目前,國內對于三金合八正散化裁治療泌尿系結石的臨床研究較多,部分臨床醫生選用中西藥結合方案治療本病,但缺乏實驗研究論證。本實驗復制濕熱型石淋大鼠模型,通過泌尿系統超聲影像檢查、尿液p H值監測及結石重量比較,分析三金合八正散與諾氟沙星對濕熱型石淋大鼠治療效果的差異。本研究超聲影像結果顯示,西藥、中西醫聯合用藥及中藥中劑量對大鼠膀胱、腎臟病變緩解情況基本相同,中藥高劑量對大鼠結石溶解及排出的效果較西藥,中西醫聯合用藥,中藥中、低劑量明顯,而各組大鼠尿路結石重量比較也顯示出與超聲影像相同的結果。其中諾氟沙星通過殺菌作用,減少尿素酶產生,使尿素分解為氨和二氧化碳的量減少,進而限制合成氫氧化銨,尿液p H值降低,酸性條件下磷酸鎂銨溶解度增大,不易析出,抑制結石生成及增大,減輕膀胱、腎臟梗阻,減輕腎盂積水。同時,諾氟沙星的殺菌作用減輕了感染局部及全身的炎癥反應,減少膀胱平滑肌細胞的變性、壞死,同時促進其損傷后的再生和修復,從而減輕膀胱壁不規則增厚。從中醫角度分析,三金合八正散有清熱利濕、通淋排石的作用,有助于減輕局部組織水腫、充血等炎癥癥狀,有效緩解腎盂積水、膀胱壁不規則增厚等病理改變。

尿液p H值監測結果說明中西藥聯合及中藥高、中、低劑量都有不同程度的尿液酸化作用,其中中西醫聯合用藥及中藥高、中劑量對尿液p H值影響大致相同。西藥組大鼠尿液p H值曲線在用藥之初明顯降低,給藥后緩慢升高,最終仍呈弱堿性,考慮為諾氟沙星無法殺滅參與構成結石核心的細菌,以及長時間使用抗生素,細菌對其產生耐藥性,使尿素酶生成未被完全抑制所致,說明諾氟沙星可在短時間內抑制細菌繁殖,因而結石重量較小,但在酸化尿液方面不及中西醫聯合用藥和中藥的治療效果。

本次實驗結果顯示,三金合八正散對濕熱型石淋大鼠的治療作用優于單純使用西藥,且與中西藥聯合應用相比治療效果無顯著差異。由于本實驗造模時間短,形成結石較小,故實驗中出現中藥高劑量組對大鼠結石溶解及排出的影響比其他各治療組明顯的現象。因此,有關三金合八正散排石、溶石作用是否與劑量相關及其作用機制有待進一步研究。