Witec alpha 300M+激光共聚焦顯微拉曼光譜儀 使用與維護初探

張秀英

（南京工業大學先進材料研究院，江蘇 南京 211816）

1928 年，印度物理學家C. V. Raman 在用汞燈的單色光照射ccl4液體時，發現當光與ccl4分子相互作用后，在液體的散射光中觀測到了頻率低于入射光頻率的新譜線，通過對這些新譜線的研究可以得到ccl4分子結構的信息，因此這種效應被命名為Raman 效應，這種新譜線則被命名為拉曼光譜。

近年來，隨著計算機技術、激光技術和高靈敏度探測器等的不斷發展，拉曼光譜技術已經成為分析測試領域不可缺少的一部分。一幅拉曼光譜圖可包括單個或者多個拉曼散射峰，每個拉曼散射峰可反映所測物質的拉曼散射峰的峰強、峰位和峰寬等信息，與光照射物質時其某種分子的分子鍵振動和轉動能級差一一對應，類似于人類指紋識別的效果，因而也稱之為“指紋峰”，通過分析拉曼散射峰可得到所測物質材料的化學組成、晶體的結晶度、材料厚度以及形態等信息。同時與AFM，SEM，TCSPC 聯用，被廣泛應用于高分子材料鑒定、生物分子鑒定、稀有礦物質鑒定等領域，在當今材料表征方法中占據重要地位。

1 基本工作原理

Witec alpha 300M+激光共聚焦顯微拉曼光譜儀的工作原理如圖1 所示，一束激光經過單模光纖入射到分光器，被分光器反射后進入顯微物鏡，經過顯微物鏡聚焦入射到已經聚焦好的樣品表面處某微小區域內，該微區內的樣品被入射激光照射后激發出拉曼信號，該信號和入射激光一起被樣品反射回來后經過濾光片后被多模光纖接收，多模光纖接收的信號經過光譜儀探測分析，最終得到拉曼光譜圖，其中白光的作用是對樣品表面進行聚焦時的照明光源，“z-控制臺”的作用是調節顯微物鏡沿z 軸方向的上下，“壓電掃描臺”的作用是調節樣品x-y 軸方向的位置。

圖1 Witec alpha 300M+激光共聚焦顯微拉曼光譜儀光路圖

2 硬件參數

2.1 激光光源

Witec alpha 300M+ 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀激發光源有488nm 半導體激光器和633nm He-Ne 氣體激光器兩種。激光功率：488nm 激光功率最大值為50mw，633nm 激光功率最大值為35mw，且兩個激光器功率皆可連續調節。

2.2 光纖

儀器中用到的光纖有單模光纖和多模光纖兩種，其中入射激光是通過單模光纖傳輸的，孔徑大小為3.5um，用于采集信號接收端的光纖為多模光纖孔徑有25um，50um 和100um 三種大小可供選擇。

2.3 濾光片

對應于488nm 和633nm 激發波長均配置合適充分的濾光片，濾除等離子體線和瑞利散射。

2.4 物鏡

顯微物鏡有10 倍，數值孔徑為0.25，工作距離為11mm；20 倍鏡頭，數值孔徑為0.4,工作距離為3mm；50倍鏡頭，數值孔徑為0.7，工作距離為1.1mm；100 倍鏡頭的數值孔徑為0.9，工作距離為0.31mm 的蔡司鏡頭可供選擇使用。通過調節激光光斑大小，選擇不同物鏡，可進行原位掃描。

2.5 光譜儀

300g/mm 光 柵、600g/mm 光 柵、1800g/mm 光 柵，CCD 響應范圍：220-1100nm；拉曼頻移范圍不低于： 488nm 激發80-4500cm-1；633nm 激發80-6000cm-1；光譜分辨率：0.8cm-1；光譜重復性：±0.2cm-1；靈敏度：硅的三階拉曼峰信噪比30:1 ，無明顯N2和O2拉曼峰。

2.6 探測器

Witec alpha 300M+ 激光共聚焦顯微拉曼光譜儀配備的光譜探測器是Andor 公司的iDus 420 系列，具體參數如下表格1 所列，可采集任意指定位置的顯微拉曼光譜。

表格1

3 校準與調試

日常測試中，樣品測試結果的準確性與儀器本身精確度密不可分，Witec alpha 300M+激光共聚焦顯微拉曼光譜儀也不例外。該儀器精確度不僅與光柵、激光器、物鏡、濾光片等配件切換有關，還與儀器所處環境的溫濕度、震動、潔凈度等因素有關，為了得到準確的測試數據，在測試之前需對儀器進行校準與調試。最常見的儀器校準方法是使用單晶硅作為校準樣校準。如圖1 所示，使用Witec alpha 300M+激光共聚焦顯微拉曼光譜儀測試標準單晶硅樣品后得到的拉曼光譜圖。結果表明：在室溫條件下，單晶硅的一階拉曼峰峰位為520.7 cm-1。

圖2 標準單晶硅的拉曼峰

4 使用、管理與維護

4.1 儀器的使用

Witec alpha 300M+激光共聚焦顯微拉曼光譜儀不僅可以測試樣品的微區拉曼信號，還可以測試樣品的微區熒光信號?？蓽y樣品種類為：固體、液體、膠體、軟膏、氣體，無機材料、有機材料、生物材料，純物質、混和物等。固體樣品分固體薄膜樣品、固體粉末樣品及晶體顆粒等。其中，固體薄膜樣品的拉曼測試中需根據樣品的熒光信號是否會干擾拉曼信號，選擇合適的激發波長；固體粉末樣品測試時需先把樣品表面壓平，然后還需注意樣品平整度對聚焦的影響，選擇一塊聚焦好的區域作為測試區域，最后也要根據散射光及熒光干擾選擇合適的激發波長；晶體顆粒樣品和固體粉末樣品有點類似，唯一不同的是顆粒較大，對聚焦要求更高，需要操作者更加小心，固體粉末和晶體顆粒測試時一定要注意不要讓樣品污染到物鏡鏡頭。液體樣品分溶液、生物細胞、組織等。對無揮發及無腐蝕特性的液體可直接滴在載玻片上測試；對有揮發特性及腐蝕性的液體，需要使用毛細管吸入，然后將其兩端封閉后測試；生物細胞、組織樣品則可以放在培養皿中測試，但是要先根據培養液的揮發性和腐蝕性確定是否可行。氣體樣品測試難度較大，一般在測試前需對其進行壓縮處理，保證其密度夠大，而且還需使用強度較高的激光作為激發光，以保證能夠激發出光譜信號。

4.2 儀器的管理與維護

Witec alpha 300M+激光共聚焦顯微拉曼光譜儀資產原值在百萬以上，屬于大型分析測試儀器，實行專人管理負責制。所有意向使用儀器測試的人員須先交培訓申請表給儀器管理員，管理員根據儀器管理規章，審核后確定培訓人員名單，意向使用儀器測試人員通過儀器培訓考核后方可上機使用儀器。儀器測試實行按照機時收費制度。而且，具備預約使用資格的測試人員在享受測試權利的同時也須承擔相應的義務，如儀器維護與儀器室環境維護等。另外，儀器管理員須根據外界環境變化、預約使用記錄情況等因素定期檢查儀器本身狀態，及時校準并維護儀器，使其能夠正常有序運行。

5 結語

本文從儀器的工作原理，配套硬件參數，儀器的校準與調試及儀器的管理與維護等幾個方面對Witec alpha 300M+激光共聚焦顯微拉曼光譜儀進行了詳細的介紹，給從事分析測試儀器管理的實驗技術人員提供寶貴的儀器管理經驗，從而進一步提升儀器管理水平，為科學研究發展添磚加瓦。