食品級TiO2對豚鼠細胞毒性表達和作用的研究

楊磊，柳明，趙琢，王華，翟自芹，左玥華，孫俐，劉烜

（天津海關工業產品安全技術中心，天津300308）

近年來，納米二氧化鈦（Nano-TiO2）已在諸多領域得到了廣泛應用，特別是在食品添加劑領域。美國食品和藥品監督管理局已允許將它用于食品添加劑中，我國衛計委（原衛生部）也于2001 年公布Nano-TiO2可用于食品，但是另一方面，它對環境及人類健康的危害作用也日益得到人們的關注[1]，特別是對人類健康方面[2]。有研究報道它可在人體內多個臟器中積累并對各組織及器官產生毒性效應[3-7]。同時也有文章報道鼠皮膚涂抹納米二氧化鈦60 d 后，可在其大腦內檢出納米二氧化鈦顆粒，但這些Nano-TiO2并未對小鼠腦部造成實質性的病變影響[8]。此外，試驗表明Nano-TiO2能夠誘導小鼠大腦中膠質細胞產生應激反應從而導致神經元受損和大腦功能障礙[9]。還有試驗數據表明，鼻腔給藥后，可通過電感耦合等離子體-質譜（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）方法檢測到在小鼠的各個腦區內均含有鈦元素。然而，Nano-TiO2在腦部是否引起氧化應激反應并對大腦細胞產生毒性，從而進一步影響大腦的相關生物學功能，目前尚未系統性研究。

有試驗結果顯示，納米氧化鐵在小鼠腦細胞內相關特征數值產生變化，例如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性的增加，谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）和組成型一氧化氮合酶（construtive nitric oxide synthasec，NOS）的活性明顯增加，而谷胱甘肽還原型（L-glutathione reduced，GSH），氧化型（L-glutathione oxidized，GSSG） 比例GSH/GSSG 明顯下降，神經元細胞膜結構破壞，溶酶體增多[10-12]。本研究通過觀測納米TiO2處理后小鼠腦的病理變化，鈦在腦中的含量變化，抗氧化酶活性和重要非酶物質含量等，以及重要的神經化學分子如谷氨酸，乙酰膽堿酯酶和一氧化氮（NO）的含量指標的變化，研究納米TiO2引起的腦部氧化損傷毒性機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

Nano-TiO2、甲醛、硝酸、過氧化氫、肝素鈉（分析純）：美國Simga 公司；磷酸鹽（phosphate buffer saline，PBS）緩沖液：賽默飛世爾科技公司；總RNA 提取試劑盒：寶日醫生物技術（北京）有限公司；活性氧類測定試劑盒：南京建成生物有限公司。

1.1.2 實驗動物

實驗用ICR 小鼠購自于中國醫科大學動物中心，體重（22±2）g，性別均為雌性。飼養溫度（20±2）℃，相對濕度為（60±10）%。實驗小鼠被隨機分為6 個試驗組和1 個對照組。連續14 d，試驗組每天注射納米二氧化鈦（銳鈦礦型），劑量分別為5、10、50、100、150、200 mg/kg；對照組每天注射生理鹽水。實驗進行過程中觀察記錄小鼠攝食、行動、健康相關信息。實驗結束后逐個稱重，乙醚麻醉處死，快速剝離腦組織（腦組織分離出皮層和海馬），樣本逐個稱重，轉入細胞凍存管，-80 ℃保存待用。

1.1.3 儀器

1.2 方法

1.2.1 測定腦體比

詳細記錄每只實驗動物的體重和腦重，計算公式如下：

1.2.2 組織病理學觀察

試驗組中，選取4 只小鼠并分離腦組織。多聚甲醛（4%）26 ℃固定4 h~6 h。然后更換新鮮的固定液，4 ℃孵育過夜。PBS 液洗一次。更換30%蔗糖的PBS 溶液，直至樣品沉底為止。再次更換為新配制的30%蔗糖的磷酸緩沖液，4 ℃孵育，最后更換為100%包埋劑，過夜孵育。包埋，-80 ℃保存。切片之前將樣本塊提前放置在冰凍切片機內，冷卻1 h。組織固定后，進行石蠟包埋，蠟塊大小控制在2 cm×2 cm×0.5 cm 范圍內，75%、80%、85%、90%、95%、95%、100%、100%乙醇依次脫水，每個脫水步驟時長4 h。石蠟切片厚度小于5 μm左右，放入55 ℃溫水浴箱中展片，撈片，70 ℃過夜烤片，貼牢。石蠟切片經二甲苯脫蠟10 min，重復一次，然后依次放入100%、95%、90%、80%、70%的各級乙醇溶液中，每個步驟保持10 min，3%雙氧水封閉10 min，最后放入蒸餾水中。蘇木精-伊紅染色不超過4 min，依次蒸餾水沖洗，酸性酒精沖洗，蒸餾水沖洗，0.5%氨水沖洗，中性樹脂封片，光鏡下觀察細胞形態。

1.2.3 小鼠腦組織中的鈦元素含量

取0.3 g 腦組織進行消化，將組織放入消解罐中，加入0.5 mL 濃硝酸，過夜消化。隨后，在反應液中加入0.5 mL 的過氧化氫（H2O2）。將消解罐在160 ℃加熱至組織塊徹底溶解。將溫度降低至120 ℃繼續加熱，直至所得溶液最終為無色透明，確保所有硝酸被除盡。最后，用3.0%硝酸將所得溶液定容至3.0 mL。小鼠大腦組織中的鈦含量，采用電感耦合等離子質譜儀來進行測定。

1.2.4 腦組織中的活性氧類含量

將剝離出的小鼠大腦組織用PBS 沖洗干凈，濾紙吸干；轉入提取器中，加入50 mmol/L 的Tris-HCl（pH 7.4）制成勻漿。8 000 r/min 離心20 min，取上清液備用。根據羥胺法測定腦組織中的氧自由基含量。取上清液0.2 mL，加入10 mmol/L 鹽酸羥胺溶液0.2 mL，25 ℃孵育20 min。加入1.0 mL CHCl3，混勻后靜置20 min 萃取。8 000 r/min 離心20 min 取上清液。529 nm 波長條件下測定最終溶液吸光度。大腦組織中的H2O2含量用商業試劑盒來進行檢測。活性氧類檢測試劑盒，利用的是2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酯（2'，7'-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）作為標記。細胞內的活性氧類（reactive oxygen species，ROS）可以將無熒光的2'，7'-二氯二氫熒光素（2'，7'-dichlorohydrofluorescein，DCFH）氧化成有熒光的2'，7'-二氯熒光素（2'，7'-dichlorofluorescein，DCF）。因此，測定DCF 的熒光就可以獲知細胞內活性氧類的水平。

1.2.5 腦組織中的脂類過氧化物含量

丙二醛（modeldriven architecture，MDA）是反映細胞膜脂過氧化程度的常用指標，本實驗通過測定MDA 含量來反應小鼠腦組織中的脂類過氧化物水平。實驗首先將剝離出的小鼠大腦組織進行勻漿，用0.15 mmol/L HCl 溶液，其中含有3.0%硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）裂解組織。將裂解混合液在80 ℃孵育120 min，最終用丁醇萃取TBA-MDA 混合物，測定吸光度及MDA 含量。

1.2.6 腦組織中的抗氧化酶活性

剝離出的小鼠大腦組織用PBS 沖洗干凈，濾紙吸干；轉入提取器中，加入用冰預冷的1 % 聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVPP）的PBS 溶液（50mmol/L，pH7.6），制成勻漿。15000r/min 離心20min，取上清備用。分別測定上清液中的超氧化物歧化酶值、過氧化氫值（catalase from micrococcus lysodeikticus，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）值及谷胱甘肽過氧化物酶的活性。

采用商業試劑盒測定APX 活性。向每100 μL 組織勻漿液中，加入50 mmol/L PBS 溶液，25 mmol/L 抗壞血酸，100 μmol/L EDTA-Na2，以及17 mmol/L H2O2。每30 s 測定290 nm 波長下吸光度值（A290）。抗壞血酸過氧化物酶活單位以1 min 內A290減少0.1 單位的酶量為一個單位行計算。GSH-Px 的活性利用商業試劑盒測定。

1.2.7 腦組織中抗氧化劑的含量

利用檢測設備為熒光分光光度計測定小鼠的腦組織勻漿液的GSH 和GSSG 含量，激發波長350 nm，發射波長420 nm。同樣對組織勻漿液中的還原型抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）和氧化型抗壞血酸（dehydroascorbic acid，DASA）含量進行測定，取60 μL 樣本腦組織勻漿液，加入600 μL 3%CHCl3；37 ℃孵育4 h，加入1.0 mL 60%的H2SO4終止反應。采用2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB）法對上述產物進行測定，蛋白質含量用Lowry 法進行測定。

1.2.8 腦組織中神經化學物質的含量

在大腦中，一氧化氮（NO）的合成主要依賴于一氧化氮合成酶（NOS）的專一性催化。NOS 主要有兩種類型：組成型（cNOS）和誘導型（iNOS），在大腦正常生理功能中起到有重要作用。乙酰膽堿酯酶（AchE）在神經信號的傳導和功能實現中同樣具有關鍵作用。對其含量及活性測定均采用相應的商業試劑盒完成。

1.3 數據分析

試驗數據用平均數及標準差進行表示。SPSS 13軟件數據分析軟件。多組數據之間的組間方差差異采用ANOVA 進行分析。各處理組與對照組之間的差異采用Dunnett-t 檢驗來進行分析。如果P＜0.05，表示存在顯著性差異，具有統計學意義。

2 結果與討論

2.1 小鼠腦體比的變化

在本實驗中，各試驗組小鼠的腦體比測定數據參見表1。

表1 連續給藥納米TiO2 后ICR 小鼠的體重與腦重變化Table 1 Changes of the net weight and brain of ICR mice after administration of TiO2

結果表明，各小組中小鼠的體重未見明顯差異，說明給藥不同劑量的納米二氧化鈦對小鼠體重無顯著性影響。在腦體比這一指標上，低劑量組與對照組相比無顯著性差異。但隨著Nano-TiO2給藥劑量的增加，腦體比呈現出逐漸下降的趨勢，有明顯的劑量依賴效果，隨著給藥劑量的升高，與對照組相比的差異逐漸達到了顯著水平（P＜0.05）和極顯著水平（P＜0.01）。最終在高劑量組中檢測到了腦萎縮，說明在該劑量Nano-TiO2已對小鼠腦組織造成了嚴重損傷。

2.2 小鼠大腦組織的病理改變

小鼠大腦組織的病理改變可見圖1 所示。

圖1 小鼠大腦組織的病理切片結果Fig.1 Pathological changes in mice brain tissue

圖1a、圖1b 中，與對照組相比，50 mg/kg 處理組小鼠大腦組織中的神經細胞形態表現正常，處理組與對照組之間未表現出顯著性差異。但隨著給藥劑量的升高，在100 mg/kg 劑量的試驗組中，觀察到了有部分腦神經細胞出現了局部區域的細胞破裂和裂解（圖1c）。當劑量增加到150 mg/kg 時，我們可以觀察到在大腦組織中出現了炎癥細胞侵潤現象，說明較高濃度的Nano-Tio2可對小鼠大腦組織造成明顯損傷并產生炎癥反應（圖1d）。

2.3 鈦在大腦組織中的含量

鈦元素在ICR 小鼠大腦組織中的含量可見于表2。

表2 連續給藥納米TiO2 之后小鼠腦組織中的鈦元素分布Table 2 Content of Ti in brain after TiO2 administration

在5、10 mg/kg 兩個低劑量組中，未能在試驗組和對照組中發現鈦元素含量的顯著性差異。但隨著Nano-TiO2給藥劑量的增加，腦體比呈現出逐漸下降的趨勢，有明顯的劑量依賴效果，隨著給藥劑量增加，與對照組相比的差異均達到了顯著水平（P＜0.05）甚至極顯著水平（P＜0.01）。

2.4 小鼠大腦組織中的氧自由基和脂類過氧化水平

ICR 小鼠大腦組織中的氧自由基（O2-·和H2O2）和脂質過氧化水平變化情況可參照表3。

表3 TiO2 連續給藥后，小鼠大腦組織中的氧自由基和脂類過氧化水平變化Table 3 Generation rate of ROS and lipid peroxidation in brains with TiO2 administration

在5、10 mg/kg 兩個低劑量組中，未能在試驗組和對照組中發現氧自由基（O2-·和H2O2）和脂質過氧化水平（MDA 含量）存在顯著性差異。但隨著Nano-TiO2給藥劑量增加，在高劑量組50、100、150、200 mg/kg TiO2處理組中，（O2-·和H2O2）和（MDA）含量也顯著提高，與對照組相比表現出了顯著性差異或極顯著差異。在不同的指標上，無論是氧自由基還是脂質過氧化水平，高劑量給藥組都明顯高于低劑量給藥組，說明大腦組織的氧化應激反應強度與Nano-TiO2的給藥劑量呈一定的劑量依賴性。

實驗中，小鼠腦組織中的抗氧化系統酶活性改變結果見表4。

表4 連續給藥納米二氧化鈦后，小鼠大腦組織中各種抗氧化酶的變化Table 4 The activities of antioxdative enzymes in brains with TiO2 administration

續表4 連續給藥納米二氧化鈦后，小鼠大腦組織中各種抗氧化酶的變化Continue table 4 The activities of antioxdative enzymes in brains with TiO2 administration

僅在5 mg/kg 劑量組中未能發現APX、CAT、GSHPx 和SOD 的活性存在顯著性差異。隨著納米二氧化鈦給藥劑量的增加，與對照組相比，在TiO2給藥劑量為10、50、100、150、200 mg/kg 的處理組中，APX、CAT、GSH-Px 和SOD 的活性明顯逐步降低。

小鼠大腦組織中的還原/氧化型抗壞血酸（ASA/DASA）比例，以及還原/氧化型谷胱甘肽（GSH/GSSG）比例水平的變化情況見圖2。

圖2 TiO2 連續給藥后小鼠腦組織中（ASA/DASA）比例和谷胱甘肽還原型/氧化型（GSH/GSSG）的比例Fig.2 Ratio of ASA/DASA and GSH/GSSG in mice brains with administration of TiO2

在5 mg/kg 低劑量組中，未能在試驗組和對照組中發現ASA/DASA 和GSH/GSSG 水平的顯著性差異。但隨著劑量的增加，在較高劑量組10、50、100、150、200 mg/kg TiO2處理組中，ASA/DASA 和GSH/GSSG 的比例降低顯著。值得注意的是，與10 mg/kg～100 mg/kg的劑量組相比，150 mg/kg 和200 mg/kg 的高劑量組中的ASA/DASA 和GSH/GSSG 比例降幅相對較小。而濃度的增加也使得總抗氧化能力（T-AOC）降低。

2.7 小鼠大腦中一氧化氮合酶及一氧化氮水平的改變

ICR 小鼠大腦組織中的一氧化氮合酶（NOS）活性和一氧化氮（NO）水平的變化情況可參照表5。

表5 連續給藥TiO2 后小鼠腦組織中的NOS 與NO 水平Table 5 The activities of antioxdative enzymes in brains with TiO2 administration

在5、10 mg/kg 低劑量組中，未能在試驗組和對照組中發現NOS 和NO 水平的顯著性差異。但隨著納米二氧化鈦給藥劑量的增加，在較高劑量組50、100、150、200 mg/kg TiO2處理組中，NOS 和NO 水平明顯上升，與對照組相比具有顯著性差異。

2.8 小鼠大腦組織中的谷氨酸及乙酰膽堿酯酶改變

在實驗中，未能在試驗組和對照組中發現谷氨酸（Glu）和乙酰膽堿（AchE）水平的顯著性差異。但隨著Nano-TiO2給藥劑量的增加，在較高劑量組50、100、150、200 mg/kg TiO2處理組中，Glu 和AchE 的水平逐漸下降，與對照組相比具有顯著性差異。

3 討論與結論

隨著Nano-TiO2在各種醫藥、材料、涂料、以及各類食品領域中的廣泛應用，人類接觸Nano-TiO2的頻率越來越高，在諸多接觸方式中，食品類往往最容易被忽視，而Nano-TiO2經呼吸道、消化道和皮膚進入人體是最主要的入侵方式。本實驗中，利用5、10、50、100、150、200 mg/kg 的劑量Nano-TiO2對小鼠進行14 d 連續腹腔給藥注射并對各參數進行比較分析。實驗結果表明，各小組中小鼠的體重未見明顯差異，說明給藥不同劑量的納米二氧化鈦對小鼠體重無顯著性影響。在腦體比這一指標上，低劑量組與對照組相比并無顯著性差異。在高劑量處理組中檢測到了腦萎縮，說明Nano-TiO2已對腦組織造成了嚴重損傷，隨著納米TiO2給藥劑量的增加，腦體比呈現出逐漸下降的趨勢；但腦組織中鈦元素的含量持續升高，有明顯的劑量依賴效果。值得注意的是，在高劑量處理組中，還出現了腦神經細胞的形態改變和炎癥性細胞侵蝕。

已有試驗表明，鼻腔能夠直接吸入納米TiO2顆粒，這些顆粒可通過嗅神經進入腦組織并聚集在海馬區[12-15]，這些試驗的最終結果都是導致神經元細胞的降解[16-20]。納米顆粒還被證明能穿過血腦屏障并轉移到中樞神經系統。通過本實驗結果，證實了腹腔給藥和鼻腔吸入納米TiO2所引起的效應的一致性。這些結果說明，小鼠大腦組織受到的損傷是由納米TiO2直接或間接引起的。通過進一步對腦組織受損的狀況進行了觀察與研究，發現炎癥可在多種大腦組織中的增殖與蔓延，還觀察到神經元壞死和脫落的神經元胞體，小鼠海馬核的不規則和細胞變性。這些實驗現象都表明，氧自由基能夠攻擊腦內的不飽和脂肪酸，進而引起腦組織損傷[21-22]。在顯微鏡下的觀察結果提示腦細胞受損的嚴重程度與給藥劑量具有一定的劑量依賴性。

在本研究中，在試驗組和對照組中發現氧自由基和脂質過氧化水平并未存在顯著性差異。但在高劑量組，與對照組相比，其氧自由基和脂質過氧化水平都明顯升高，表現出了顯著性差異。而且，無論是比較氧自由基還是脂質的過氧化水平，高劑量給藥組都明顯高于低劑量給藥組，這說明腦組織的氧化應激程度與Nano-TiO2具有相當程度的劑量依賴性。同時也未能在低劑量試驗組和對照組中發現APX、CAT、GSH-Px和SOD 的活性存在顯著性差異，但隨著劑量的增加，在劑量組15、50、100、150、200 mg/kg TiO2處理組中，APX、CAT、GSH-Px 和SOD 的活性逐步降低，表現出了顯著性差異。在試驗組和對照組中發現ASA/DASA和GSH/GSSG 并未顯著性差異，但隨著給藥劑量的增加，在較高劑量組10、50、100、150、200 mg/kg TiO2處理組中，ASA/DASA 和GSH/GSSG 比例明顯降低。

本研究結果還表明，在所有的神經膠質細胞，在接觸到二氧化鈦納米粒子后引起細胞增殖，提示除大腦損傷以外，還有炎癥/免疫反應會發生在海馬區域。如果小鼠的神經炎癥是由TiO2納米粒子觸發，那么是否可以通過改變相關的基因表達和蛋白參與的信號通路（如Toll 樣受體和炎性細胞因子）來避免免疫能力降低。曾經有研究指出，腹腔注射或灌胃14 d 或30 d的TiO2納米粒子后會產生相關的炎癥級聯反應和肝組織病理學變化。但是目前尚未發現納米顆粒對動物和人類神經炎癥直接相關的信號通路。