不同發(fā)酵方式及發(fā)酵劑菌比對米發(fā)糕揮發(fā)性成分的影響

龔川杰，姜萌藝，李美倫，何利

（四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川雅安625014）

米發(fā)糕（fermented rice cake）是我國南方地區(qū)的傳統(tǒng)發(fā)酵大米制品，成品表面光滑，內(nèi)呈蜂窩狀，無論冷熱，均口感松軟綿甜，有發(fā)酵所產(chǎn)生的特殊而令人愉快的風味物質(zhì)，易被人體消化吸收[1-2]。四川地區(qū)的米發(fā)糕具有特殊的酒香和酸甜風味，其傳統(tǒng)的生產(chǎn)方式是自然發(fā)酵或在新鮮米漿中接入老漿（前一天制作米發(fā)糕留下來的發(fā)酵好的米漿液）發(fā)酵[3]，產(chǎn)品的品質(zhì)和生產(chǎn)操作控制主要依賴于制作者的經(jīng)驗與技能。此外，老漿不便保存及運輸，不同的保存條件易導致其中復雜的微生物菌種比例和活性發(fā)生變化，進而影響后續(xù)發(fā)酵的米發(fā)糕質(zhì)量，限制了米發(fā)糕的大規(guī)模生產(chǎn)。

風味物質(zhì)的多少及和諧程度是判斷米發(fā)糕品質(zhì)的重要指標。研究表明，米發(fā)糕的風味和口感與米漿中酵母菌和乳酸菌的種類、菌種比例、加糖量、接種量、發(fā)酵時間和發(fā)酵溫度密切相關(guān)[4-7]。目前的主要研究對象是湖南湖北地區(qū)[8-12]的米發(fā)糕，且關(guān)于不同地區(qū)的米發(fā)糕中主要揮發(fā)性成分與所占比重存在分歧[13-14]，尚未有對四川地區(qū)米發(fā)糕的研究。假絲酵母在食品發(fā)酵方面的研究與應用較少，可為米飯和醬油增香[15-17]。現(xiàn)已知釀酒酵母屬對米發(fā)糕發(fā)酵過程中風味物質(zhì)的形成起重要作用[13-14，18]，未見篩選出假絲酵母屬為優(yōu)勢發(fā)酵菌屬，以及其對米發(fā)糕風味物質(zhì)影響的相關(guān)報道。本試驗采用頂空固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（headspace solid phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS），對比四川省雅安地區(qū)市售老漿發(fā)酵、自然發(fā)酵及不同菌比人工接種發(fā)酵制作的米發(fā)糕揮發(fā)性風味成分種類及含量，結(jié)合其質(zhì)構(gòu)特性，考察不同發(fā)酵方式及發(fā)酵劑菌比對米發(fā)糕風味的影響，為復合發(fā)酵劑在米發(fā)糕實際發(fā)酵、生產(chǎn)中的進一步應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：課題組前期從市售米發(fā)糕老漿中分離篩選、甘油管藏的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum，編號為R2b），矮小假絲酵母（Candida humilis，編號為J1a）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，編號為J3a）。

培養(yǎng)基：MRS 培養(yǎng)基與麥芽汁培養(yǎng)基分別用于分離和培養(yǎng)米漿樣品中的乳酸菌及酵母菌。培養(yǎng)基所用蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、磷酸氫二鉀、檸檬酸二銨、乙酸鈉、葡萄糖、吐溫-80、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、瓊脂、碳酸鈣、麥芽浸出粉及氯霉素：均為分析純，雅安市萬科化學試劑公司。早秈米、白砂糖：食品級，市購。

表1 米發(fā)糕樣品Table 1 Fermented rice cake samples

1.2 儀器與設(shè)備

JM-B20002 電子天平：余姚市紀銘稱重校驗設(shè)備有限公司；PTDG-32 型蒸鍋：山東惠當家電器有限公司；JL-100 電動多用磨漿機：重慶市友呂機械制造有限責任公司；45 mm 硅膠馬芬杯蛋糕模具：安琪酵母股份有限公司；60 目分樣篩：雅安市萬科化學試劑有限公司；TA-XT plus 型物性分析儀：英國Stable Micro systems 公司；7890A-5975C GC-MS 質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）色譜柱：美國Agilent 公司；57330-U SPME 手動進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS 57328-U 萃取頭：美國Sigma 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 米發(fā)糕的制作

1.3.1.1 工藝流程

1.3.1.2 米漿的制作

早秈米在30 ℃下浸泡24 h，用磨漿機磨粉，米粉用60 目分樣篩過篩，將過篩后的米粉與水按8 ∶2 的質(zhì)量比混勻制得米漿。

1.3.1.3 自然發(fā)酵米發(fā)糕的制作

自制米漿在室溫下（25 ℃左右）自然發(fā)酵8 h 制得發(fā)酵米漿，將發(fā)酵好的米漿定量盛入45 mm 硅膠馬芬杯模具中，沸水蒸20 min，得到米發(fā)糕。

1.3.1.4 人工接種發(fā)酵米發(fā)糕的制作

將J1a、J3a 和R2b 分別在28 ℃和37 ℃活化24 h，按2 %的接種量接入液體培養(yǎng)基中，根據(jù)菌株的生長曲線，確定其對數(shù)生長末期（乳酸菌濃度達到108CFU/mL，酵母菌濃度達到107CFU/mL～108CFU/mL）為擴大培養(yǎng)時間，于恒溫培養(yǎng)箱中進行擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)結(jié)束后，將新鮮菌液以4 000 r/min 離心30 min，用生理鹽水（0.9%）洗滌后復懸，將乳酸菌與酵母菌以R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3、J1a ∶R2b=1 ∶9、J1a ∶R2b=9 ∶1、J3a ∶R2b=1 ∶9、J3a ∶R2b=9 ∶1 的體積比混合得到液態(tài)復合發(fā)酵劑，按感官評分得分最高的參數(shù)接入所有比例的液態(tài)復合發(fā)酵劑及白砂糖，即加糖量為米漿質(zhì)量的20%，接種量為米漿質(zhì)量的6 %，32 ℃下發(fā)酵8 h制得發(fā)酵米漿；同時按感官評分得分最低的參數(shù)接入菌種體積比為R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3 的液態(tài)復合發(fā)酵劑及白砂糖，即加糖量為米漿質(zhì)量的10%，接種量為米漿質(zhì)量的14%，32 ℃下發(fā)酵10 h 制得發(fā)酵米漿。蒸煮方法同上，制得米發(fā)糕。

1.3.2 米發(fā)糕中揮發(fā)性風味物質(zhì)的測定

1.3.2.1 頂空固相微萃取法提取揮發(fā)性成分

精密量取米發(fā)糕樣品5 g 移入20 mL 的頂空瓶中，用硅橡膠隔墊密封壓緊，于60 ℃磁力攪拌器上加熱平衡15 min 后，使用CAR/DVB/PDMS 三層復合萃取頭頂空吸附40 min（一直保持60 ℃水?。?，然后將萃取頭插入質(zhì)譜儀進樣口，解析5 min，平行3 次。

1.3.2.2 氣相色譜質(zhì)譜分析

氣相色譜條件：色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）石英毛細管柱；載氣：氦氣，純度≥99.999%；柱流速：1 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：萃取頭在進樣口解析5 min，脈沖無分流進樣；柱溫程序：起始溫度40 ℃保持3 min，以4 ℃/min 升至150 ℃，再以10 ℃/min 升至250 ℃，保持10 min。

質(zhì)譜條件：色譜-質(zhì)譜接口溫度：250 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；離子化方式：電子電離源（electron ionization，EI）；電子能量：70 eV；質(zhì)量范圍35 AMU/s~350 AMU/s[19]。

1.3.2.3 揮發(fā)性成分定性分析

各組分質(zhì)譜結(jié)果經(jīng)NIST.11 譜庫進行檢索，根據(jù)相似度（surface ionization，SI）≥80 確認其香氣成分，采用面積歸一化法計算樣品中各組分的相對含量。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

應用Origin2016 進行作圖，使用SPSS20.0（IBM 公司）做方差分析，差異的顯著性水平為0.05。對不同發(fā)酵方式及不同菌比米發(fā)糕的揮發(fā)性物質(zhì)進行主成分分析。

1.3.4 米發(fā)糕質(zhì)構(gòu)特性測定

采用P/36 R 探頭對樣品進行質(zhì)構(gòu)分析（texture profile analysis，TPA），參數(shù)設(shè)置：測定前速度5 mm/s，測定速度2 mm/s，測定后速度5 mm/s，應變位移60%，引發(fā)力5 g[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 米發(fā)糕樣品截面圖

樣品1~9 的成品圖見圖1。

2.2 米發(fā)糕揮發(fā)性成分GC-MS 分析

樣品1~9 的總離子流色譜圖見圖2。

不同菌比及發(fā)酵方式所得米發(fā)糕揮發(fā)性成分組成及相對含量見表2。

圖1 米發(fā)糕樣品1～9 截面圖Fig.1 Cross-sectional views of fermented rice cake samples 1-9

圖2 米發(fā)糕樣品1～9 的總離子流圖Fig.2 Total ion current maps of volatile components of fermented rice cake samples 1-9

表2 不同菌比及發(fā)酵方式所得米發(fā)糕揮發(fā)性成分組成及相對含量Table 2 The composition and content of volatile components of fermented rice cake obtained by different bacteria ratio and methods

續(xù)表2 不同菌比及發(fā)酵方式所得米發(fā)糕揮發(fā)性成分組成及相對含量Continue table 2 The composition and content of volatile components of fermented rice cake obtained by different bacteria ratio and methods

由表2 可知，9 種米發(fā)糕中共檢出67 種揮發(fā)性成分，包括酯類30 種，醇類8 種，醛類8 種，酮類3 種，酸類5 種，酚類3 種，胺類1 種，烴類4 種，醚類1 種，雜環(huán)類3 種，含鉛物質(zhì)1 種。酯類、醇類、醛類、酸類化合物的種類多、相對含量高，其中酯類物質(zhì)所占比重分別為44.423 7%、0.130 3%、0.791%、6.522 1%、6.791 3%、0.47%、1.623 3%、1.751 5%、0.612 3%。醛類所占比重分別為1.083 2 %、3.682 7 %、8.573 6 %、2.376 6 %、2.1609%、7.789 6%、7.573 9%、10.574 2%、11.601 4%。酯類和醛類物質(zhì)往往具有花、果香氣，對米發(fā)糕的揮發(fā)性成分呈正向貢獻[21]。醇類所占比重分別為8.246 1%、19.312 1%、4.302 6%、28.868 1%、31.42%、33.005 8%、29.3856%、39.6775%、32.8382%。酸類所占比重分別為0、0、9.554 5%、1.951 8%、0.081 3%、4.478%、5.269%、0、4.708 3%。進一步證明酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生的CO2和醇類物質(zhì)等，能使產(chǎn)品質(zhì)地蓬松，許多發(fā)酵食品如面包、果酒、啤酒、黃酒、干酪、醬油以及烏龍茶等都帶有芬芳的香味，香味物質(zhì)都是由酵母在發(fā)酵過程中自然形成[22]。乳酸菌在發(fā)酵過程中分泌的乳酸，可以使米發(fā)糕具獨特而柔和的酸味。首次在四川地區(qū)的米發(fā)糕中檢測出甲氧基苯肟，這在其他研究米發(fā)糕揮發(fā)性物質(zhì)的文獻中未見報道，具體形成原因還需進一步研究。

2.3 不同發(fā)酵方式及菌比對米發(fā)糕質(zhì)構(gòu)特性的影響

不同發(fā)酵方式及菌比對米發(fā)糕質(zhì)構(gòu)特性的影響見表3。

表3 不同菌比米發(fā)糕質(zhì)構(gòu)測定結(jié)果和感官評價結(jié)果Table 3 The result of TPA and sensory evaluation

根據(jù)表3 可知，9 種樣品在回復性和內(nèi)聚性上僅2號、5 號和9 號有顯著性差異，在其他方面都有顯著性差異（P＜0.05），因此選擇硬度、彈性、膠著性和咀嚼性評價米發(fā)糕的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。相關(guān)文獻表明，米發(fā)糕的硬度、膠著性和咀嚼性與其品質(zhì)呈負相關(guān)[23-26]。市售1、2號樣品的彈性、內(nèi)聚性、咀嚼性差異較大，硬度較其他樣品而言較小，米發(fā)糕充分發(fā)酵，內(nèi)部空隙細膩綿密，松軟適中，是較為理想的產(chǎn)品。自然發(fā)酵由于未添加菌種，因此發(fā)酵不充分，產(chǎn)品過硬，彈性較小，膠著性和咀嚼性均較大，品質(zhì)不佳。菌種體積比為R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3 在感官評價得分最高的正交條件下發(fā)酵制得的米發(fā)糕（樣品5）硬度、膠著性和咀嚼性均最小，即使在最差的發(fā)酵條件下，硬度、膠著性和咀嚼性也明顯小于其他樣品，說明該復配菌比有利于菌株間的協(xié)同發(fā)酵作用，達到甚至超越了市售產(chǎn)品品質(zhì)，可以改善米發(fā)糕的質(zhì)構(gòu)品質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

不同生產(chǎn)方式生產(chǎn)的米發(fā)糕均含有苯甲醛和甲氧基苯肟，苯甲醛是具有苦杏仁氣味的一種苷，甲氧基苯肟的報道較少，有研究認為黏細胞附著在柚子皮上生長發(fā)酵所得產(chǎn)物，因此甲氧基苯肟具有柚子果皮及果肉香[27]，也有研究認為是棗花蜜中的共有成分，是構(gòu)成濃郁棗花香氣的主要原因[28]；還有相關(guān)研究表明其為合歡葉、莖揮發(fā)油的主要化學成分[29]。除了自然發(fā)酵樣品外，均含有苯乙醇，人工接種發(fā)酵的米發(fā)糕中苯乙醇含量明顯高于市售米發(fā)糕。苯乙醇對香氣的影響最大，具有新鮮的面包香，清甜的玫瑰樣花香。市售米發(fā)糕成分種類差異非常大，含有多種酯，含量低，閾值高，香氣值小于1，呈香物質(zhì)較少。市售樣品1 中含量最高的油酸甲酯無香味，與其他地區(qū)市售產(chǎn)品的主要成分不同，可能是由于四川地區(qū)米發(fā)糕的生產(chǎn)工藝與湖廣地區(qū)不同，也可能是由于店鋪的蒸籠蒸煮除米發(fā)糕以外的含油食物所致。自然發(fā)酵樣品中乙酸含量最高，這與陽盈盈等[14]的檢測結(jié)果一致，但產(chǎn)生的辛酸略有不愉快味，三甲胺具有魚腥臭，姜黃烯有甜橙、姜和良姜的混合香氣，略帶辣、苦味[30]，對產(chǎn)品風味帶來不良影響，且比容小，質(zhì)構(gòu)特性較差，產(chǎn)品質(zhì)量不易控制。

矮小假絲酵母是一種公認安全的酵母[31]，其與乳酸菌存在一定的營養(yǎng)關(guān)系，二者常作為天然發(fā)酵劑廣泛應用于面包、動物飼料、谷物等一些烘焙產(chǎn)品中[32]。接種J1a 與接種J3a 的雙菌發(fā)酵劑相比，酸類物質(zhì)的種類和含量顯著增加，但酸類物質(zhì)閾值一般較低，酸類物質(zhì)過多會影響產(chǎn)品風味，帶有酸腐味。在相同的酵母菌與乳酸菌菌比下，接種兩種不同的酵母菌都產(chǎn)生了9 種共有成分，各自產(chǎn)生4 種～5 種特有成分，說明矮小假絲酵母與釀酒酵母對米發(fā)糕發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)均有影響。

接種不同菌比發(fā)酵劑在相同條件和不同條件下發(fā)酵生產(chǎn)的米發(fā)糕中，三菌發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性成分均在20 種以上，雙菌發(fā)酵劑產(chǎn)生的揮發(fā)性成分種類在14 種左右，說明三菌混合發(fā)酵在雙菌的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了許多新的風味物質(zhì)。由釀酒酵母和植物乳桿菌復配的雙菌發(fā)酵劑發(fā)酵制得的米發(fā)糕中苯乙醇（32.662 9%）和苯甲醛（10.039 6%）含量尤其高，這與相關(guān)研究中提出的主要揮發(fā)性成分為正戊醇[14]存在分歧。菌種體積比為R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3 在感官評價得分最高的條件下發(fā)酵制得的米發(fā)糕香氣成分純正、濃郁，含有其他雜質(zhì)成分氣味少，優(yōu)化發(fā)酵工藝后可以提高米發(fā)糕的品質(zhì)。

通過測量與分析不同發(fā)酵方式及發(fā)酵劑菌比制備的米發(fā)糕樣品的揮發(fā)性成分及質(zhì)構(gòu)特性，得米發(fā)糕的主要芳香性成分為苯乙醇、甲氧基苯基肟，且接種發(fā)酵劑制作的樣品中二者的含量比市售樣品大大增多，在四川地區(qū)米發(fā)糕中檢測出的特征性物質(zhì)甲氧基苯肟與醇、醛、酯、酸共同形成米發(fā)糕特有香氣。接入菌種體積比為R2b ∶J1a ∶J3a=1 ∶6 ∶3 的液態(tài)復合發(fā)酵劑在加糖量為米漿質(zhì)量的20%，接種量為米漿質(zhì)量的6%，32 ℃下發(fā)酵8 h 制得發(fā)酵米漿蒸制出的米發(fā)糕揮發(fā)性成分最豐富，總量較高，且富有彈性和韌性，內(nèi)部的氣孔大小均勻，孔壁厚薄均一，外觀膨松飽滿，感官品質(zhì)好，整體品質(zhì)優(yōu)于市售產(chǎn)品和自然發(fā)酵產(chǎn)品?；谝陨涎芯?，植物乳桿菌、釀酒酵母菌及矮小假絲酵母菌作為復合發(fā)酵劑可用于米發(fā)糕的生產(chǎn)，能解決自然發(fā)酵與老漿發(fā)酵所得產(chǎn)品存在的質(zhì)量不穩(wěn)定、衛(wèi)生不可控等問題，也可為其他發(fā)酵米制品的研究提供參考。