TIMP1基因對肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮細胞HEPApiC凋亡的影響及機制研究

常大蕓 劉學工 李寧華 王曉麗 戴蕾蓮 王曉輝 王義濤

肺炎是指由微生物(細菌，病毒或真菌)、物理和化學因素、免疫損傷、過敏或藥物等引起的下呼吸道、肺泡和肺間質的炎癥。細菌性肺炎是最常見的肺炎形式之一，也是最常見的傳染病之一[1]。許多類型的細菌可能引起細菌性肺炎，包括肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌和銅綠假單胞菌等。肺炎鏈球菌是引起肺炎的最常見原因，而這種病理在5歲以下及65歲以上的患者中更為嚴重。在嬰兒和老年人中，細菌性肺炎仍然是致命的肺病[2-3]。因此，更好地了解肺炎的發病機制可能有助于制定有效的治療策略。基質金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1，TIMP1)基因屬于TIMPs家族成員之一，其主要功能是抑制基質金屬蛋白酶的活性，促進細胞外基質的沉積，并抑制其降解[4]。近年來研究發現，TIMP1在呼吸系統炎癥性疾病中發揮重要作用。如王愛華等[5]人報道，在支氣管哮喘小鼠組織中TIMP-1異常表達；余霓雯等[6]研究指出，TIMP-1參與慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)的進展；但TIMP-1在肺炎中的研究相對較少。近期研究發現[7]，TIMP-1在嬰幼兒重癥肺炎外周血血清中呈高表達，提示TIMP-1的表達量可能作為判斷肺炎的預后指標。然而，關于TIMP-1在細菌性肺炎中的作用機制尚不十分清楚。因此本實驗以肺炎鏈球菌干預肺泡上皮細胞HEPApiC模擬細菌性肺炎體外模型，探究TIMP-1基因對肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡的影響及機制，以期為細菌性肺炎治療提供新的思路。

資料與方法

一、材料

人肺泡上皮細胞HEPApiC、肺炎鏈球菌R6(美國ATCC細胞庫)；胎牛血清、DMEM培養基(美國Gibco公司)；胰蛋白酶(杭州四季青生物工程材料有限公司)；Trizol試劑、脂質體Lipofectamine 2000轉染試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉錄試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；SYBR Premix Ex Taq mix檢測試劑盒(日本TaKaRa公司)；CCK-8試劑、RIPA細胞裂解液(上海碧云天生物技術研究所)；Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物有限公司)；BCA蛋白檢測試劑盒(武漢云克隆動物有限公司)；ECL化學發光檢測試劑盒(上海愛必信生物科技有限公司)；TIMP1 siRNA及對照siRNA control(上海吉瑪制藥有限公司)；TIMP1 抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體及二抗(美國Abcam公司)；TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

二、細胞培養

人肺泡上皮細胞HEPApiC培養在高糖DMEM培養基中，其中含有10%胎牛血清，放置在5%CO2、37℃恒溫培養箱中，細胞貼壁生長，待細胞匯合度達80%以上時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，按照1∶3比例進行傳代培養，對數生長期的HEPApiC細胞用于實驗。

三、細胞處理和分組

對數生長期的HEPApiC細胞接種到6孔板中，置37℃培養箱繼續培養，將HEPApiC細胞分為4組，空白對照組、感染組、陰性對照組和干擾組。其中空白對照組是未做任何處理的HEPApiC細胞；感染組是HEPApiC細胞生長匯合度達90%時加入1×108個/mL的肺炎鏈球菌R6進行感染；陰性對照組是HEPApiC細胞生長匯合度達50%時以Lipofectamine 2000轉染試劑轉染siRNA control，轉染48 h后加入1×108個/mL的肺炎鏈球菌R6進行感染；轉染組是HEPApiC細胞生長匯合度達50%時以Lipofectamine 2000轉染試劑轉染TIMP1 siRNA，轉染48 h后加入1×108個/mL的肺炎鏈球菌R6進行感染。轉染具體操作步驟嚴格按照轉染試劑說明書進行。

四、QPCR檢測

各組HEPApiC細胞干預48 h后，分別收集各組細胞，根據Trizol試劑使用說明書提取各組HEPApiC細胞中總RNA，測定RNA的純度和濃度，使用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，并使用SYBR Premix Ex Taq mix檢測試劑盒，以cDNA為模板進行QPCR檢測。以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算各組HEPApiC細胞中TIMP1 mRNA相對表達水平。

五、Western blot檢測

分別收集處理48 h后各組HEPApiC細胞，分別加入RIPA裂解液在冰上提取細胞中總蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，待蛋白分離后切斷電源，將蛋白轉印至硝酸纖維素膜上，將膜放置在5%脫脂奶粉的封閉液中室溫封阻2 h。TBST洗膜后分別加入相應一抗(TIMP1一抗為1∶500稀釋、Bcl-2一抗為1∶800稀釋、Bax一抗為1∶800稀釋)，4 ℃雜交過夜，TBST洗膜后再加入1∶2000稀釋的二抗，室溫雜交2 h，TBST洗膜后加入ECL化學發光液，顯影、定影，經成像系統掃描，采用Quantity One軟件分析條帶灰度值，以GAPDH為內參，以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值表示目的蛋白相對表達水平。

六、CCK-8法檢測

將HEPApiC細胞以3×103個/孔接種到96孔板中，放置在37℃培養箱繼續培養，根據上述1.3方法分組和處理，分別在24、48、72 h采用CCK-8法檢測細胞活力，簡言之，在各個時間點向每孔細胞中加入10 μL CCK-8溶液，37℃繼續孵育4 h，使用酶標儀測定570 nm波長處光密度值(A值)，計算細胞活力(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。

七、流式細胞術檢測

各組HEPApiC細胞處理48 h，采用0.25胰蛋白酶消化細胞，離心并收集。使用預冷的PBS洗滌細胞2次，向細胞中加入100 μL 1×Binding Buffer懸浮細胞，依次向細胞懸液中加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5 μL，輕輕混勻，室溫下避光反應15 min，再向細胞懸液中加入400 μL 1×Binding Buffer，隨即上流式細胞儀進行檢測。

八、ELISA檢測

分別處理48 h的各組HEPApiC細胞上清液，分別采用TNF-α、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒測定上清中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具體操作步驟參照ELISA檢測試劑盒說明書。

九、統計學分析

結 果

一、各組HEPApiC細胞中TIMP1的表達水平

QPCR和Western blot檢測結果顯示，肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細胞中TIMP1 mRNA和蛋白表達水平明顯高于空白對照組(P<0.05)；轉染TIMP1 siRNA后HEPApiC細胞中TIMP1 mRNA和蛋白表達水平顯著低于陰性對照組和感染組(P<0.05)；感染組和陰性對照組相比較，細胞中TIMP1 mRNA和蛋白表達水平差異不顯著(P>0.05)(見圖1、表1)。

圖1 Western blot檢測各組HEPApiC細胞中TIMP1蛋白表達情況

表1 各組HEPApiC細胞中TIMP1 mRNA和蛋白表達水平比較

注：與空白對照組比，*P<0.05；與感染組比，&P<0.05；與陰性對照組比，#P<0.05

二、敲低TIMP1基因表達對HEPApiC細胞活力的影響

CCK-8檢測結果顯示，肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細胞活力明顯低于空白對照組(P<0.05)；敲低TIMP1后HEPApiC細胞活力高于陰性對照組和感染組(P<0.05)；而感染組和陰性對照組相比較，細胞活力差異不顯著(P>0.05)(見表2)。

三、敲低TIMP1基因表達對HEPApiC細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細胞凋亡率明顯高于空白對照組(P<0.05)；敲低TIMP1后HEPApiC細胞凋亡率明顯低于陰性對照組和感染組(P<0.05)；而感染組和陰性對照組相比較，細胞凋亡率差異不顯著(P>0.05)(見圖2、表3)。

四、敲低TIMP1基因表達對HEPApiC細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達的影響

Western blot檢測結果顯示，肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯低于空白對照組(P<0.05)，Bax蛋白表達水平明顯高于空白對照組(P<0.05)；敲低TIMP1后HEPApiC細胞中Bcl-2蛋白表達水平明顯高于陰性對照組和感染組(P<0.05)，Bax蛋白表達水平明顯低于陰性對照組和感染組(P<0.05)；而感染組和陰性對照組相比較，細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平差異不顯著(P>0.05)(見圖3、表4)。

表2 CCK-8檢測各組HEPApiC細胞活力

注：與空白對照組比，*P<0.05；與感染組比，&P<0.05；與陰性對照組比，#P<0.05

圖2 流式細胞術檢測各組HEPApiC細胞凋亡情況

表3 各組HEPApiC細胞凋亡率比較

注：與空白對照組比，*P<0.05；與感染組比，&P<0.05；與陰性對照組比，#P<0.05

圖3 Western blot檢測各組HEPApiC細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平

表4 各組HEPApiC細胞中Bcl-2和Bax蛋白水平比較

注：與空白對照組比，*P<0.05；與感染組比，&P<0.05；與陰性對照組比，#P<0.05

五、敲低TIMP1基因表達對炎癥因子表達的影響

ELISA檢測結果顯示，肺炎鏈球菌感染后HEPApiC細胞培養上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯高于空白對照組(P<0.05)；敲低TIMP1后HEPApiC細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量明顯低于陰性對照組和感染組(P<0.05)；而感染組和陰性對照組相比較，細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量差異不顯著(P>0.05)(見表5)。

表5 ELISA檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6含量

注：與空白對照組比，*P<0.05；與感染組比，&P<0.05；與陰性對照組比，#P<0.05

討 論

根據世界衛生組織的統計數據，肺炎每年造成約160萬人死亡，已成為全世界主要公共衛生問題[8]。估計有90%的肺炎相關死亡發生在發展中國家，革蘭氏陽性菌如肺炎鏈球菌引起的肺炎占所有重癥肺炎病例的很大一部分[9-10]。肺炎發病機制目前尚不完全清楚，多項研究發現肺泡上皮細胞作為肺組織肺泡屏障功能的細胞與肺炎的發生和發展密切相關[11-12]。研究表明，TIMP-1基因在調節機體生長發育及生理病理等過程均發揮重要功能。最近Mammen等人的結果顯示，TIMP-1缺乏導致小鼠哮喘表型，表現出氣道高反應性，增強嗜酸性粒細胞炎癥和T輔助細胞2型細胞因子基因和蛋白質表達卵清蛋白致敏；從TIMP-1敲除小鼠過敏性哮喘模型分離的肺組織中檢測發現炎癥因子的表達顯著增加[13]。Wu等研究顯示，IL-33可通過誘導MMP-9和TIMP-1之間的失衡來調節細胞外基質的沉積并促進肺纖維化過程[14]。Wills報道指出，在TIMP-1表達低的非小細胞肺癌患者，使用異丙腎上腺素聯合貝伐單抗具有良好的抗腫瘤活性[15]。近期Jia等人通過鑒定來自健康對照的外周血樣品與患有細菌性肺炎的患者之間的差異表達的基因發現，TIMP-1等五個關鍵基因在革蘭氏陽性細菌引起的肺炎患者外周血中表達上調，提示TIMP-1等基因可能與細菌性肺炎的發病密切相關[16]。然而關于其在肺炎中的作用及其機制的研究仍然較少，本實驗發現，在肺炎鏈球菌誘導的肺泡上皮HEPApiC細胞中TIMP-1 mRNA和蛋白表達量明顯升高，提示TIMP-1的過表達可能參與肺炎的發生。本研究通過在HEPApiC細胞中轉染TIMP-1 siRNA，探究敲低TIMP-1對肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡的影響及可能的分子機制。

研究顯示，肺泡上皮細胞凋亡在肺炎發生和發展中發揮關鍵性作用。Shi等研究顯示，肺炎支原體通過激活外部死亡受體途徑，促進肺泡上皮細胞的凋亡來影響兒童肺炎的發展[17]。Suliman的研究暗示肺炎損傷的AT2細胞中的線粒體質量控制活化促進肺泡上皮細胞存活，抑制細胞凋亡以支持肺泡功能[18]。本實驗結果發現，肺炎鏈球菌能夠抑制HEPApiC細胞活力，而敲低TIMP-1能夠上調HEPApiC細胞活力。且肺炎鏈球菌能夠促進HEPApiC細胞凋亡，而敲低TIMP-1能夠部分逆轉肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡。Western blot檢測結果顯示，肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞中促凋亡蛋白Bax的表達水平明顯升高，抑凋亡蛋白Bcl-2的表達水平明顯降低，而敲低TIMP-1能夠下調Bax的表達，上調Bcl-2的表達。提示，敲低TIMP-1可能通過上調Bcl-2的表達和下調Bax的表達阻礙肺炎鏈球菌誘導的HEPApiC細胞凋亡。炎癥反應的激活是導致肺炎發生的重要因素之一，而炎癥因子的大量合成和分泌，勢必導致炎癥級聯反應最終引發組織器官受損[19-20]。TNF-α的過度表達能夠引起炎癥反應的失控加重組織損傷，嚴重時可導致全身性炎癥反應[21]。IL-1β主要由活化的單核巨噬細胞產生，能夠誘導巨噬細胞炎癥蛋白等多種炎癥因子的合成和分泌[22]。IL-6是一種主要由淋巴細胞和單核巨噬細胞分泌的促炎因子，其可直接參與炎癥反應及組織損傷[23]。以往研究顯示，在肺炎組織中，TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子的表達顯著升高[24-25]。本實驗結果表明，肺炎鏈球菌處理HEPApiC細胞后，上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量顯著升高，而敲低TIMP-1能夠減少TNF-α、IL-1β和IL-6的含量。提示TIMP-1可能通過抑制肺炎鏈球菌誘導的炎癥反應降低細胞凋亡來阻礙肺炎的發生和發展。

綜上，敲低肺泡上皮HEPApiC細胞中TIMP1基因表達，能夠抑制肺炎鏈球菌誘導的細胞凋亡，其作用機制可能通過抑制肺炎鏈球菌誘導炎癥反應來實現，但TIMP1在肺炎中的具體作用機制仍需深入探討。本實驗為進一步研究細菌性肺炎的發病機制奠定一定的基礎，為靶向TIMP1治療細菌性肺炎提供理論依據。