miR-146a和miR-155與慢性阻塞性肺疾病炎癥表型的相關性分析

席卓娜 喬亞紅 程方圓

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種較為常見的呼吸系統疾病，以持續性氣流受限為主要特征[1]。目前臨床癥狀和肺功能是COPD診斷與病情分級的主要依據，但易受年齡等因素影響，不能全面評估病情[2]。對COPD表型的研究是臨床研究熱點之一，明確COPD表型有利于在治療期間選取合適治療手段并提高患者預后情況。目前COPD表型分類方法主要包括臨床表型、生理表型、炎癥表型、影像學表型等[3]。COPD與有毒顆粒或氣體的慢性炎性反應增強有關，因此炎癥表型具有判斷COPD病情程度的天然優勢。同時有研究表明，miR-146a、miR-155均與炎癥反應相關[4-5]，因此本研究探討miR-146a和miR-155與炎癥表型相關性，進一步完善對COPD炎癥表型分類的認識。

資料與方法

一、一般資料

收集2015年7月～2019年6月本院收治的COPD患者179例，其中男85例，女94例，年齡30～61歲。納入標準：符合COPD診斷中急性加重診斷標準[6]；研究前未接受糖皮質、β2受體激動劑治療。排除標準：嚴重心肺并發癥患者；合并肺部腫瘤、支氣管哮喘等慢性疾病患者。根據誘導痰分析炎癥細胞比例的不同，COPD分為嗜酸性粒細胞型(嗜酸性粒細胞占總細胞的2.5%以上)、嗜中性粒細胞型(嗜中性粒細胞數為61%以上)、混合粒細胞性(嗜酸性粒細胞2.5%以上，嗜中性粒細胞數為61%以上)及粒細胞缺乏型(嗜酸性粒細胞2.5%以下，嗜中性粒細胞數為61%以下)[7]。四組一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)(見表1)。

表1 四組一般資料比較

二、方法

1 標本采集

所有研究對象均于就診次日清晨抽取肘靜脈血5 mL，3000 r/min、-20℃離心20min，取上清，平均分為兩份，做好標記-80℃保存。

2 qRT-PCR法檢測血清miR-146a、miR-155水平

參照Trizol說明書提取血清總RNA，應用Bio Rad逆轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA，25℃ 5min，42℃30 min，85℃ 5min滅活逆轉錄酶活性，用去離子水將cDNA稀釋10倍后-20℃保存。進行qRT-PCR操作。程序設定為：95 ℃預熱3min，(95 ℃ 30 s ，60 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s)循環35，72℃ 5min終止反應。miR-146a、miR-155以U6為內參基因，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設計(見表2)。采用2-ΔΔCt算法計算miR-146a、miR-155相對表達量。

表2 qRT-PCR引物序列

3 各表型特征指標檢測

取1.2.1血清標本，采用一氧化氮測定儀檢測FeNO水平；采用比色法測定血清MPO水平，采用722S分光光度計(上海精密科學儀器有限公司生產)，在460 nm處讀取吸光度(OD)值,試劑為南京建成生物工程研究所的MPO測試盒；采用免疫熒光定量法檢測C反應蛋白(C-reactive protein，CRP)水平，試劑盒為南京基蛋生物科技有限公司的CRP試劑盒。

三、統計學分析

結 果

一、指標檢測

與粒細胞缺乏型相比，嗜酸性粒細胞型患者FeNO水平顯著升高(P<0.05)，MPO、CRP水平差異不顯著(P>0.05)，嗜中性粒細胞型患者MPO、CRP水平顯著升高(P<0.05)，FeNO水平差異不顯著(P>0.05)，混合粒細胞型患者FeNO、MPO、CRP水平均顯著升高(P<0..05)；與嗜中性粒細胞型相比，嗜酸性粒細胞型、混合粒細胞型患者FeNO水平顯著升高(P<0.05)；與嗜酸性粒細胞相比，嗜中性粒細胞型、混合粒細胞型患者MPO、CRP水平顯著升高(P<0.05)(見表3)。

表3 各組FeNO、MPO、CRP水平檢測

注：a、b、c分別代表與粒細胞缺乏型、嗜酸性粒細胞型、嗜中性粒細胞型相比，P<0.05。

二、各炎癥表型血清miR-146a、miR-155表達水平

與粒細胞缺乏型相比，嗜酸性粒細胞型miR-146a水平顯著升高(P<0..05)，嗜中性粒細胞型MPO、CRP、miR-155水平顯著升高(P<0.05)，混合粒細胞型miR-146a、miR-155水平均顯著升高(P<0.05)；與嗜中性粒細胞型相比，嗜酸性粒細胞型、混合粒細胞型miR-146a水平顯著升高(P<0.05)；與嗜酸性粒細胞相比，嗜中性粒細胞型、混合粒細胞型miR-155水平顯著升高(P<0.05)(見表4)。

表4 各表型血清miR-146a、miR-155表達水平比較

注：a、b、c分別代表與粒細胞缺乏型、嗜酸性粒細胞型、嗜中性粒細胞型相比，P<0.05。

三、血清miR-146a、miR-155表達水平與炎癥分型相關性分析

Pearson相關性分析表明，嗜酸性粒細胞型患者中，miR-146a水平與FeNO、CRP呈正相關(r=0.659，P<0.05)；嗜中性粒細胞型患者中，miR-155水平與MPO、CRP水平呈正相關(r=0.628，0.605，P=0.007)，混合粒細胞型患者中miR-146a、miR-155水平與FeNO、MPO、CRP水平均呈正相關(r=0.724，0.514，0.671，0.605，0.525，0.509，P<0.05)，粒細胞缺乏型患者中，miR-146a、miR-155水平與FeNO、MPO、CRP水平均無相關性(r=0.121，0.106，0.210，0.229，0.107，0.213，P>0.05)(見表5)。

表5 血清miR-146a、miR-155表達水平與炎癥分型相關性分析

討 論

COPD是一種具有氣流阻塞特征的慢性支氣管炎和肺氣腫，是一種常見的慢性疾病。與氣道、肺臟對有毒顆粒或氣體的慢性炎性反應增強有關，致殘率與病死率極高，嚴重危害患者生存狀態。目前臨床診斷COPD主要通過常規肺功能檢查，但其方法具有一定局限性，同一肺功能水平患者可能有不同臨床表現、生存狀態，對同一種治療方法敏感性亦不同。研究不同表型可區分不同COPD患者，有助于為患者提供臨床個性化治療方案，更具有針對性。目前對COPD表型分類方法多種多樣，包括臨床表型、影像學表型、炎癥表型等。其中炎癥表型能夠精細明確COPD的致病來源，可作判斷COPD急性加重并評估預后的參考。炎癥反應與炎性標志物具有密切相關性，炎性標志物能對炎癥反應作出更精確表達。有研究表明，miR-146a、miR-155與炎癥反應均有相關性，但其在COPD炎癥分型中研究甚少，為此本研究通過分析COPD患者血清miR-146a、miR-155水平與COPD炎癥分型及其特異性炎性標志物相關性，為COPD的靶向治療提供理論基礎。

以嗜酸性粒細胞為主的COPD患病者血清炎癥介質水平較低，對標準治療反應良好，Pazdrak等[8]研究表明，COPD患者有35%患者嗜酸性粒細胞升高，此類患者對糖皮質激素較為敏感，取得療效優于其他類型。Bjermer[9]研究表明，FeNO與呼吸系統疾病的嚴重程度密切相關。Wagener等[10]研究表明FeNO可反映氣道嗜酸性粒細胞的炎癥程度，并可準確量化，不受時間控制，隨時檢測，迅速得結果。本研究中嗜酸性粒細胞型患者FeNO水平顯著高于其他類型患者，表明FeNO水平可作為COPD患者嗜酸性粒細胞型分型的指標。miR-146a由miR-146加工產生，位于5q34。研究表明，miR-146a在炎癥環境下高表達[11]。Yang等[12]研究表明，miR-146a水平可能與嗜酸性粒細胞密切相關。本研究中，嗜酸性粒細胞型患者血清miR-146a水平顯著高于粒細胞缺乏型及嗜中性粒細胞患者，且相關性分析顯示，嗜酸性粒細胞型患者血清miR-146a水平與FeNO水平正相關，提示miR-146a水平與嗜酸性粒細胞型COPD患者密切相關，嗜酸性粒細胞型COPD患者可能是由于miR-146a水平升高導致。

中性粒細胞型患者細菌感染多，需將強藥物治療，因此住院時間及康復時間顯著延長[13]。MPO是由中性粒細胞、單核細胞和某些巨噬細胞分泌的血紅素蛋白酶，可與中性粒細胞表面抗體結合，通過p38MAKP途徑激活中性粒細胞樣爆發、脫顆粒等反應，促進中性粒細胞參與炎癥反應，介導炎癥組織損傷[14]。CRP水平是區分細菌感染與病毒感染的敏感指標[15]。本研究中，中性粒細胞型患者MPO、CRP水平顯著高于粒細胞缺乏型、嗜酸性粒細胞型患者，提示MPO、CRP水平可作為判斷中性粒細胞的分型標準，二者高表達顯示COPD患者屬于中性細胞型。miR-155是一個典型的多功能microRNA,位于非編碼區基因Bic內，在免疫、炎癥的調控中發揮重要作用[16-17]。有研究表明肺炎患者中性粒細胞活檢中miR-155水平顯著升高[18]。本研究中，嗜中性粒細胞型患者miR-155水平顯著高于粒細胞缺乏型、嗜酸性粒細胞型患者，此外，嗜中性粒細胞型患者血清miR-155水平與血清MPO、CRP水平正相關，提示嗜中性粒細胞型COPD患者可能是由于miR-155水平升高導致。粒細胞缺乏型患者血清炎癥介質較低，對標準治療反應良好，與miR-146a、miR-155水平均無相關性，而混合粒細胞型患者血清miR-146a、miR-155水平均升高，且二者均與FeNO、MPO、CRP水平正相關，從另一個側面反映miR-146a、miR-155水平與COPD的分型有關，可能為臨床個性化、精確化治療提供參考。

綜上所述，血清miR-146a、miR-155水平與COPD患者炎癥分型密切相關，為臨床個性化治療提供理論依據，但本研究病理術較少，納入可能不全面，需進一步擴大樣本進行研究。