肺腺癌中同源盒蛋白SIX-6和基質金屬蛋白酶-14的表達及預后意義

王芳 孔亞洲

肺腺癌是呼吸系統中最常見的腫瘤，具有原位腺癌-微浸潤腺癌-浸潤性腺癌，漸進發展的過程。浸潤性腺癌具有明顯的侵襲性，生物學行為不良，近年研究認為腫瘤細胞中不同蛋白表達失調是其進展的重要因素[1]。同源盒蛋白SIX-6(SIX-6)是機體內轉錄調節蛋白中的一種，對細胞增殖的作用較強，并能誘導腫瘤細胞出現轉移[2]。基質金屬蛋白酶-14(MMP-14)是轉移相關蛋白，是MMPs家族中的重要成員，是膜型基質金屬蛋白酶，在腫瘤細胞中分泌增多，可以促進細胞外基質的降解，使腫瘤轉移的通路打開，為轉移提供直捷能通路[3]。肺腺癌中SIX-6和MMP-14的檢測尚未見報道，本研究檢測肺腺癌中SIX-6和MMP-14的表達，分析其相關性及對判斷預后的價值。

資料與方法

一、標本與資料

本研究為前瞻性研究。研究經醫院倫理委員會批準。選擇2013.5-2015.3期間在我院經病理確診為肺腺癌并行根治術的患者作為觀察組。納入標準：①臨床相關資料完整；②符合WHO中病理診斷標準；③家屬簽屬知情同意書。排除標準：①肺部手術史；②有遺傳性疾病者；③術前行放、化療者。共觀察85例，其中男41例，女44例，年齡42～84歲，平均54.5歲。選擇42例肺微浸潤性腺癌作為對照組1，其中男22例，女20例，年齡44～80歲，平均55.7歲。選擇42例肺原位腺癌作為對照組2，其中男23例，女19例，年齡42～79歲，平均53.4歲。選擇觀察組中距腫物邊緣大于3厘米的正常肺組織42例作為對照組3，其中男21例，女21例，年齡43～81歲，平均56.5歲。組間的一般資料比較中無明顯差別，具有可比性(經卡方檢驗和方差分析P>0.05)(見表1)。

表1 四組基線資料的比較

二、SIX-6和MMP-14表達

術后標本均常規福爾馬林固定、脫水及石蠟包埋后切取4μm切片。SIX-6和MMP-14的檢測均基于石蠟包埋的組織。SIX-6和MMP-14均購自蘇州睿瀛生物技術公司，試劑均為濃縮液，預實驗判斷顯色最佳的濃度(SIX-6為1∶150，MMP-14為1∶200)。正式實驗應用免疫組化二步法，DAB顯色，嚴格按說明操作，減少人為誤差，做好質控。

三、SIX-6和MMP-14結果評定

SIX-6陽性表達部位是細胞漿，MMP-14的陽性表達部位是細胞漿和(或)細胞膜。以著色強度和陽性率二維角度進行綜合評定陽性，即：著色強度：無0分；弱1分，中等2分，強3分。選擇上皮細胞集中的區域進行陽性率的判斷(400倍視野)：以<5%為0分，6～10%為1分，11～30%為2分，31～50%為3分，>51%為4分。二者相乘，以≤4分計為陰性，以>4分計為陽性，計算陽性率。

四、統計學措施

應用SPSS 17.0分析，組間率的比較行卡方檢驗，定量資料的組間比較采用t檢驗、多組間的兩兩比較采用P值修正的方法(P<0.0083才能認為有統計學差異)。對數據進行線性相關性分析及生存分析。所以統計均為雙側檢測以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、四組中SIX-6和MMP-14的比較

四組中SIX-6和MMP-14的陽性率差別有統計學意義。(見圖1～8，表1、2)。

二、SIX-6和MMP-14在肺腺癌不同臨床特征分組中的比較

肺腺癌中SIX-6和MMP-14的表達與病理形態、脈管浸潤、淋巴結轉移及TNM分期相關，SIX-6的表達與增殖指數、肺膜累犯相關，MMP-14的表達與腫瘤最大徑相關。二者的表達與性別、年齡及吸煙等因素無關(見表3)。

表2 四組中SIX-6和MMP-14陽性率的比較

注：組間比較進行概率分割，即P值修正的方法。*vs對照組1,#vs對照組2,&vs對照組3P均<0.0083。

圖1 SIX-6在正常肺組織中陰性表達(IHC ×100) 圖2 SIX-6在原位腺癌中陰性表達(IHC 100倍) 圖3 SIX-6在肺微浸潤性腺癌中陽性表達(IHC ×100) 圖4 SIX-6在肺腺癌中陽性表達(IHC ×200) 圖5 MMP-14在正常肺組織中陰性表達(IHC ×100) 圖6 MMP-14在原位腺癌中陰性表達(IHC ×100) 圖7 MMP-14在肺微浸潤性腺癌中陽性表達(IHC ×200) 圖8 MMP-14在肺腺癌中陽性表達(IHC ×400)

表3 肺腺癌不同分組中SIX-6和MMP-14的陽性率比較

三、觀察組中SIX-6和MMP-14表達的相關性分析

線性相關分析顯示觀察組中SIX-6和MMP-14呈正相關(r=0.43，P=0.034)。

四、觀察組中SIX-6和MMP-14表達與生存時間的關系

對患者增加病例數到402例進行隨訪，隨訪患者術后的生存時間為4～60個月，平均20.4個月。其中SIX-6陽性為203例，陰性為199例，MMP-14陽性為197例，陰性為205例。經生存分析顯示SIX-6和MMP-14的表達與生存時間相關(P<0.05)，即二者高表達患者的預后差(見圖9～10)。

圖9 SIX-6蛋白的表達與生存時間的有關系

圖10 MMP-14蛋白的表達與生存時間的有關系

討 論

肺腺癌發生過程與肺泡上皮的不典型增生有關，病變具有多種類型，最常見的為腺泡型、貼壁生長型、乳頭型、微乳頭型及實體型。部分病例對肺膜可有累犯，并可對周圍組織形成明顯的侵襲，也可伴有淋巴道播散和遠隔器官的轉移。腫瘤間質中可以觀察到炎細胞浸潤和纖維化等間質反應[4]。MMPs既可以降解細胞外基質、基底膜和IV型膠原，還對細胞的異位定植有重要作用[5]。MMP-14是間質的溶解素，結構特征是有N-末端前導肽、催化和C-末端血紅素結構域，其對纖維連接蛋白的降解作用明顯。研究顯示正常肺泡上皮常無明顯的MMP-14的分泌，其常為陰性表達，在腫瘤性病變時MMP-14的生成明顯增多，在上皮細胞質中高表達，與鋅和半胱氨酸連接的失控有關[6]。MMP-14還能通過絲氨酸蛋白酶降解因子及MMP-2等發揮轉移促進作用[7]。MMP-14可以抑制細胞的凋亡，提高腫瘤的活性作用。SIX-6是近年發現的與多種組織器官發育有關的蛋白[8-9]，其在成熟組織和細胞中表達少，在細胞異型增生后表達上調。研究認為SIX-6轉錄過程中能調控多種促癌基因的表達，如對cyclinAl表達進行上調，有效促進腫瘤細胞的失控性增生[10-11]。近年也有研究認為SIX-6能增強TGF的轉錄，促進血管內皮生成因子(VEGF)的分泌，調控腫瘤間質血管內皮細胞的增殖，促進脈管生成[12]。SIX-6可以促進上皮細胞粘附作用的下降，引起細胞間連接的不穩定，促進轉移的發生。也有研究顯示SIX-6可以促進上皮間質的轉化，SIX-6引起腫瘤浸潤的前沿枝芽狀細胞表達間葉源性標志物，使上皮和間充質的抗原表達具有相似性[13]。

本研究結果顯示四組中SIX-6和MMP-14的表達差別有統計學意義，提示二者在原位癌到浸潤性腺癌發展過程中的促進作用明顯，SIX-6和MMP-14的作用類似癌基因，SIX-6對腺癌的作用可能更直接。結果顯示SIX-6和MMP-14的表達與病理形態、脈管浸潤及淋巴結轉移相關，提示二者表達上調可以促進腫瘤的進展及播散。SIX-6的表達與增殖指數和肺膜累犯相關，提示SIX-6可以促進腫瘤的增殖和肺膜累犯，SIX-6對細胞增殖的作用與促進PCNA和CyclinA1活性直接相關，SIX-6可以促進腫瘤細胞的局部侵襲，使其呈枝芽狀浸潤及局部播散。MMP-14可能對腫瘤生長有一定作用，但是其主要作用是降解腺癌細胞周圍的基底膜，使腫瘤細胞能穿過基底膜，形成轉移灶。線性相關分析顯示觀察組中SIX-6和MMP-14呈正相關，提示二者具有正向協同作用，SIX-6可能是上游蛋白，高表達后促進MMP-14的分泌，調節轉移。SIX-6對腫瘤細胞遷移的調控作用還表現為對基質金屬蛋白酶的調節上，使腫瘤間質中轉移的屏障作用減弱或消失[14]。SIX-6對腫瘤的調節作用還表現為抑制腫瘤細胞的凋亡，使細胞具有“永生化”的特征[15]。因此SIX-6的作用較SIX家族中其它成員的作用可能更廣泛，其調控腫瘤進展的通路更多。SIX-6能通過調節核因子-κB等分子生物學途徑發揮作用，核因子-κB在激活后可以加速腫瘤細胞的遷移[16]。還有研究顯示其它因子可以調節MMP-14蛋白的表達，如FSCN1和HIF-1a等[4,7]。因此SIX-6和MMP-14的作用機制可能更復雜，需要更多的實驗來驗證其調控的具體過程。本實驗在一定程度上證實了SIX-6和MMP-14表達與生存時間的關系，檢測二者的表達與預后可能有關，但是具體應用需要進一步增加病例，并經過多中心研究并進行統計數據分析后證實。但是我們在實驗中也發現，本研究僅在蛋白水平上觀察了SIX-6和MMP-14的表達，其mRNA水平和DNA水平的研究可能對證實本研究更有意義，后繼研究我們將針對SIX-6和MMP-14表達的分子水平進行關注，并探討其更多的影響因素對SIX-6和MMP-14的干擾作用，多層次、多角度闡明SIX-6和MMP-14在肺腺癌中的臨床意義及作用機理。

總之，肺腺癌中SIX-6和MMP-14表達升高可以促進腫瘤的發生和進展，二者有一定的相關性，聯合檢測SIX-6和MMP-14表達可能對判斷預后有一定價值。