PLCγ1 在小鼠卵母細胞減數分裂恢復中的作用

郝肖瓊,賈方毅,付旭陽

(1.包頭醫學院生理學教研室,內蒙古 包頭 014040;2.中國農業大學生物學院農業生物技術國家重點實驗室,北京 100094)

哺乳動物的卵母細胞從胚胎時期起就被阻滯在減數分裂I 前期的雙線期,卵泡壁層顆粒細胞產生的C 型鈉肽(NPPC)結合其鳥苷酸環化酶受體2(NPR2),產生的cGMP 是維持減數分裂阻滯的關鍵因子[1],青春期來臨后,下丘腦產生促黃體激素(LH)峰,通過促進顆粒細胞中EGF 樣生長因子的表達[2],轉激活卵丘細胞中的EGF 受體(EGFR),從而誘導卵母細胞恢復減數分裂[3]。

前期的研究表明,LH-EGFR 信號升高卵丘細胞內的鈣離子水平,高水平的鈣離子降低NPR2 與NPPC 的親和性,使NPR2 失活,cGMP 水平下降,最終導致減數分裂的恢復[4],因此,卵丘細胞內高濃度的鈣離子是卵母細胞減數分裂恢復的關鍵所在,但卵丘細胞內鈣離子水平究竟是怎樣升高的,目前還不清楚。

激活磷脂酶C(PLC)啟動磷脂酰肌醇信號通路,產生的1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)能夠升高胞內鈣離子水平。 PLC 家族具有多種同工酶,目前已發現 六 大 類： PLCβ、 PLCγ、 PLCδ、 PLCε、 PLCζ 和PLCη,共13 種亞型[5]。 PLC 廣泛分布于機體的各組織中,對機體多種生理活動做出了重要的調控。其中,生長因子受體可引起PLCγ1 的活化[6],產生IP3導致胞內鈣離子釋放,另外,PLCγ1 還參與細胞增殖、分化、受體內吞、細胞運動等活動[7-8]。

內質網IP3R 鈣庫釋放升高了胞內鈣離子水平[9-10],這一過程可通過激活PLCγ1 產生IP3實現。IP3R 基因家族編碼三種同源IP3結合蛋白,形成三種亞型[11]：IP3R1、IP3R2 以及IP3R3,受體在不同組織中存在不同的表達多樣性,在卵巢中的表達情況目前尚未有報道。

本文主要探究了LH-EGFR 信號通過PLCγ1 促進卵母細胞減數分裂的恢復,以及下游分子IP3R1的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗所用21～23 d(12～14 g) SPF 級C57BL/6J 雌性小鼠(200 只)購于中科院遺傳所實驗動物中心[SCXK (京) 2015-0019],本研究經包頭醫學院實驗動物倫理委員會批準(包院字20180901),實驗動物房[SYXK (京) 2015-0028]：22℃～24℃恒溫,12 h/12 h 光照/黑暗交替,自由采食飲水,按實驗動物使用的3R 原則給予人道關懷。

1.2 主要試劑與儀器

孕馬血清(PMSG, 浙江寧波激素廠);NPPC、EGF、milrinone、U73122、牛血清白蛋白(Sigma 公司,美國);LH(Sigma 公司,美國);Fluo 3-AM(日本同仁化學研究所);MEMα 粉末狀培養基(Gibco 公司,美國);RNA 提取試劑盒、RNA 反轉錄試劑盒(Qiagen 公司,美國);TransStart Green qPCR SuperMix(全式金公司);cGMP 檢測試劑盒(Cayman 公司,美國);免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司);蛋白質濃縮膠緩沖液、分離膠緩沖液、30%丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺溶液、5×SDS 上樣緩沖液(北京康為世紀生物科技有限公司);TEMED(Amresco 公司,美國);高靈敏度化學發光顯色液、PVDF 膜(Millipore 公司,美國);IP3R1 抗體由中國科學院動物研究所唐鐵山研究員惠贈。

體視顯微鏡、石蠟切片機(Lecia 公司,德國);A1激光共聚焦掃描顯微鏡(Nikon 公司,日本);Realtime PCR 儀(Appiled Biosystems 公司,美國);電泳儀、電泳槽(Bio-Rad 公司,美國);化學發光成像系統(北京原平皓生物技術有限公司);細胞培養膜(Millipore 公司,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 卵丘卵母細胞復合物(COCs)的分離及培養

小鼠腹腔注射PMSG 5 IU/只,44 ～46 h 后處死取卵巢,卵巢放置在預先平衡好的MEMα 液(含1 μmol/L milrinone 抑制卵母細胞成熟)中,用1 mL 注射器刺破卵泡,撿取形態良好、卵丘細胞包裹均勻的COCs,COCs 培養于含有30 nmol/L NPPC 的MEMα 液中,添加10 ng/mL EGF 以及40 μmol/L U73122;進行U73122 的劑量依賴性實驗研究時,培養液中含有30 nmol/L NPPC、10 ng/mL EGF 以及不同劑量的U73122,此外,U73122(40 μmol/L)對減數分裂自發恢復的影響也做了研究。 COCs 于37℃,5% CO2,95%濕度的培養箱培養,4 h 后,脫去卵丘細胞,觀察卵母細胞發生GVBD 的比率。 每次實驗每組使用30 枚COCs。

1.3.2 卵泡的分離及培養

卵巢取自注射PMSG 44～46 h 的小鼠,用1 mL注射器分離卵泡(直徑300 ～400 μm),將分離好的卵泡放置在0.44 μm 孔徑的細胞培養膜上,培養膜懸浮放置在35 mm 細胞培養皿中(添加1.5 mL MEMα 液),MEMα 液添加或者不添加1 μg/mL LH以及40 μM U73122;于37℃,5% CO2,95%濕度的培養箱培養,4 h 后,刺破卵泡,脫去卵丘細胞,觀察卵母細胞發生GVBD 的比率。 每次實驗每組使用20 枚卵泡。

1.3.3 卵丘細胞內鈣離子水平的檢測

COCs 取自注射PMSG 44～46 h 的小鼠卵巢,培養于MEMα 液中,MEMα 液含有30 nmol/L NPPC,添加10 ng/mL EGF 以及40 μmol/L U73122,于37℃,5% CO2,95%濕度的培養箱培養2 h,之后PBS 清洗3 次,加入5 μmol/L 鈣離子熒光探針Fluo 3-AM 孵育20 min,之后PBS 清洗3 次,在A1 激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞內鈣離子水平,綠色熒光表示胞內鈣離子水平,熒光強度代表胞內鈣離子水平相對值。 每次實驗每組使用15 枚COCs。

1.3.4 Real-time PCR

細胞樣品取自注射PMSG 44 ～46 h 的小鼠卵巢,PBS 清洗,總RNA 的提取依照RNeasy micro-RNA isolation kit 操作指南進行,總RNA 的反轉依照QuantiTek 反轉錄體系進行,得到cDNA。 在ABI 7500 Real-time PCR 系統下進行反應,每個樣品重復3 次,所有實驗重復3 次。 實驗所用引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成,引物序列見表1。

表1 Realtime-PCR 引物序列Table 1 Gene primer sequences

1.3.5 Western blot

顆粒細胞、卵丘細胞與裸卵均取自注射PMSG 44～46 h 的小鼠卵巢,加入細胞裂解液進行細胞裂解,BCA 試劑盒檢測蛋白濃度,之后加入1×SDS 上樣緩沖液,沸水煮10 min;將處理好的樣品加入凝膠中,進行凝膠電泳(5%濃縮膠,60 V,40 min,10%分離膠,100 V,1.5 h),之后采用濕法轉膜(100 V,1 h);含有5%奶粉的TBST 封閉2 h,一抗孵育4℃過夜;二抗孵育1 h,使用化學發光成像系統曝光。

1.3.6 免疫組織化學

小鼠腹腔注射PMSG 44 ～46 h 后取卵巢,置于4%多聚甲醛中固定48 h,酒精脫水、石蠟包埋、連續切片(組織厚度5 μm),用檸檬酸緩沖液進行抗原熱修復：微波爐高火4 min,低火3×4 min,然后按免疫組化試劑盒的說明進行染色、DAB 顯色、蘇木精復染,封片觀察。

1.3.7 細胞內cGMP 水平檢測

COCs 取自注射PMSG 44～46 h 的小鼠卵巢,放置于MEMα 培養液中(每組需100 枚COCs)培養2 h,MEMα 液含有30 nmol/L NPPC,添加10 ng/mL EGF 以及40 μmol/L U73122,PBS 清洗后收集各組COCs,cGMP 含量依據cGMP 酶聯免疫試劑盒中提供的方法進行檢測。

1.4 統計學分析

所有的實驗均重復至少3 次,并使用來自不同小鼠的樣本進行。 用Sigma plot 13.0 軟件進行統計學分析,數據類型采用方差分析(ANOVA)和t 檢驗,實驗數據以平均數±標準誤差(± s)表示,P＜0.05 為有顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 PLC 不同亞型mRNA 在顆粒細胞與卵丘細胞內的表達情況

激活PLC 啟動磷脂酰肌醇信號通路,使胞內鈣離子水平升高,PLC 有多種亞型,我們檢測了不同亞型在顆粒細胞與卵丘細胞中的表達情況。 結果表明,小鼠注射PMSG 44～46 h 后,卵泡壁層顆粒細胞中Plcγ1 mRNA 的表達水平遠遠高于其它亞型(P＜0.05) (圖1A),這種現象同樣出現在卵丘細胞中,卵丘細胞中Plcγ1 mRNA 的表達水平顯著高于其它亞型(P ＜0.05) (圖1B),這些結果提示PLCγ1 在減數分裂恢復中可能發揮主要作用。

圖1 PLC 不同亞型mRNA 在顆粒細胞與卵丘細胞中的表達情況Figure 1 The mRNA expression levels of PLC isoforms in granulosa cells and cumulus cells

2.2 PLCγ1 抑制劑U73122 抑制EGF 誘導的卵母細胞減數分裂恢復

注射PMSG 44～46 h 的小鼠卵泡顆粒細胞與卵丘細胞中Plcγ1 mRNA 的表達水平最高,因此PLCγ1 可能主要參與了卵母細胞減數分裂恢復的過程。 進一步研究發現添加PLCγ1 特異的抑制劑U73122 可顯著抑制EGF 誘導的卵母細胞減數分裂恢復(P ＜0.05) (圖2A),卵母細胞成熟率僅為(47.87±2.16)%,遠低于對照組(90.53±0.86)%,且U73122 的抑制效果呈劑量依賴性(圖2B),這些結果表明PLCγ1 在EGF 誘導的卵母細胞減數分裂恢復中發揮重要作用。

2.3 PLCγ1 抑制劑U73122 抑制EGF 誘導的卵丘細胞內鈣離子水平升高

圖2 PLCγ1 抑制劑U73122 對EGF 誘導的卵母細胞減數分裂恢復的影響Figure 2 The effect of U73122 on EGF-induced meiotic resumption

卵丘細胞內鈣離子水平的升高是EGF 促進減數分裂恢復的關鍵[4,12],本研究提示PLCγ1 參與了EGF 誘導的卵母細胞減數分裂恢復,EGF 可能通過PLCγ1 啟動磷脂酰肌醇信號通路,使卵丘細胞內鈣離子水平升高。 因此,同時檢測抑制PLCγ1 對卵丘細胞內鈣離子水平的影響。 與之前的研究結果相同[4],對照組卵丘細胞內鈣離子熒光強度(綠色熒光)十分微弱(圖3A),添加EGF 后顯著增加了胞內鈣離子熒光水平(圖3A),然而,PLCγ1 的抑制劑U73122 可明顯逆轉EGF 介導的胞內鈣離子水平增加(P ＜0.05) (圖3A),熒光強度同樣也顯著下降(P ＜0.05) (圖3B),這表明EGF 確實通過PLCγ1升高了卵丘細胞內的鈣離子水平,抑制PLCγ1 的作用則導致胞內鈣離子水平無法升高。

2.4 PLCγ1 抑制劑U73122 逆轉EGF 介導的胞內cGMP 水平下降

卵丘細胞內鈣離子水平升高可使NPR2 失活,cGMP 水平下降,導致減數分裂恢復[4]。 cGMP 水平的變化代表了NPR2 鳥苷酸環化酶活性的變化,本研究檢測了U73122 對COCs 內cGMP 水平的影響。結果表明,對照組添加NPPC 處理細胞,胞內cGMP水平上升,而EGF 顯著降低了胞內cGMP 水平(圖4),與之前的報道一致[1],添加U73122 顯著逆轉EGF 介導的胞內cGMP 水平下降(P ＜0.05) (圖4),這說明EGF 通過PLCγ1 升高了細胞內的鈣離子水平,高水平的鈣離子可降低NPR2 活性,導致cGMP 水平下降。

圖3 PLCγ1 抑制劑U73122 對卵丘細胞內鈣離子水平的影響Figure 3 Effect of U73122 on EGF-mediated calcium elevation

圖4 U73122 對COCs 內cGMP 水平的影響Figure 4 Effects of U73122 on cGMP levels in COCs

2.5 PLCγ1 抑制劑U73122 抑制LH 誘導的卵母細胞減數分裂恢復

根據上述研究結果,本研究進一步采用卵泡培養模型模擬體內狀態,研究U73122 對LH 誘導的減數分裂恢復的作用。 結果顯示,添加LH 誘導了減數分裂的恢復,而U73122 明顯抑制LH 誘導的減數分裂恢復(P ＜0.05) (圖5),卵母細胞的成熟率僅為(46.98±1.43)%,LH 是通過激活卵丘細胞內的EGF 受體發揮作用的[3],因此,這些結果說明LH/EGFR 信號通過PLCγ1 升高卵丘細胞內的鈣離子水平,使NPR2 失活,cGMP 水平下降,最終導致卵母細胞恢復減數分裂。

2.6 IP3R 不同亞型mRNA 在顆粒細胞、卵丘細胞與卵母細胞中的表達情況

PLCγ1 的下游分子IP3R,IP3R 具有三種亞型IP3R1、IP3R2 以及IP3R3,其相應基因為Itpr1、Itpr2以及Itpr3。 本研究發現,注射了PMSG 44 ～46 h 的小鼠卵泡顆粒細胞、卵丘細胞與卵母細胞中,Itpr1 mRNA 的表達水平均顯著高于其它兩種亞型(P ＜0.05) (圖6A、6B 和6C),提示三種亞型中IP3R1發揮主要作用。

2.7 IP3R1 在顆粒細胞、卵丘細胞與卵母細胞中的表達定位

Western blot 結果表明,IP3R1 在顆粒細胞、卵丘細胞與卵母細胞中都有表達(圖7A),免疫組織化學的結果同樣顯示IP3R1 在三種細胞中均有表達(圖7B),這說明IP3R1 在PLCγ1 升高胞內鈣離子水平的過程中發揮作用。

圖5 U73122 對LH 誘導卵母細胞減數分裂恢復中的影響Figure 5 The effect of U73122 on LH-induced meiotic resumption

圖6 IP3R 不同亞型mRNA 在顆粒細胞、卵丘細胞與卵母細胞中的表達情況Figure 6 The mRNA expression levels of IP3R isoforms in granulosa cells, cumulus cells and oocytes

圖7 IP3R1 在顆粒細胞、卵丘細胞與卵母細胞中的表達情況Figure 7 The expression of IP3R1 protein in granulosa cells, cumulus cells and oocytes

3 討論

卵泡壁層顆粒細胞表達的NPPC,可與卵丘細胞中的受體NPR2 結合,產生的cGMP 是維持卵母細胞減數分裂阻滯的關鍵因子[1],前期研究表明,LH-EGFR 信號升高了卵丘細胞內的鈣離子水平,使NPR2 與NPPC 的親和性下降,導致NPR2 失活,cGMP 水平下降,最終誘導卵母細胞減數分裂的恢復[4]。 卵丘細胞內高水平的鈣離子決定著減數分裂恢復的進程,而胞內高濃度的鈣離子是由內質網鈣庫動員導致的[4]。 本研究發現,LH/EGFR 信號通過PLCγ1 與IP3R1 升高了卵丘細胞內的鈣離子水平,導致NPR2 失活與減數分裂恢復。

內源性的PLC 是調控多種信號轉導的關鍵分子,PLC 具有多種亞型,其中,Plcγ1 mRNA 的表達水平在顆粒細胞與卵丘細胞中是多種亞型中最高的,且遠遠高于其它亞型,PLCγ1 特異的抑制劑U73122 能夠顯著抑制EGF 誘導的卵母細胞減數分裂恢復,新霉素(PLC 抑制劑)可抑制體外培養的牛和豬卵母細胞減數分裂的恢復[13],這些結果說明PLC 可能在這一過程中發揮作用。 本研究進一步證明是PLCγ1 參與了減數分裂恢復的進程。 EGFR信號與PLCγ 的活化相耦聯[14-15],而本研究表明EGFR 信號通過PLCγ1 誘導減數分裂恢復,也間接證明了這一點。

前期的研究表明,EGF 誘導卵母細胞減數分裂恢復的核心是升高了卵丘細胞內的鈣離子水平,使NPR2 失活[4,12],而激活PLCγ1 即產生IP3,升高胞內鈣離子水平。 本研究發現U73122 可以顯著抑制胞內鈣離子水平的增加,同時,U73122 也可以逆轉EGF 介導的胞內cGMP 水平下降。 結合前期研究結果,PLC 信號與鈣離子信號以EGFR 的胞內區為靶點[16],本研究進一步闡明了激活EGFR 通過PLCγ1/鈣離子導致NPR2 失活與減數分裂恢復。

LH 本質上是通過激活EGFR 發揮作用的,本研究發現U73122 顯著抑制了LH 誘導的卵母細胞減數分裂恢復,說明PLCγ1 在LH/EGFR 信號誘導減數分裂恢復中發揮重要作用。 有研究表明,PLCγ1在小鼠胚胎中廣泛表達,敲除小鼠PLCγ1 后,小鼠胚胎發育受到損傷[17],這可能是因為敲除PLCγ1影響卵子的正常發育。

激活PLC 產生的IP3是IP3R 鈣庫唯一的門控分子[18-19],而LH/EGFR 通過PLCγ1 導致的卵丘細胞內鈣離子水平升高需要IP3R 鈣庫的作用,IP3R具有3 種亞型,研究結果發現Itpr1 mRNA 的表達水平在三種亞型中最高,另外,免疫組化與Western blot 均顯示IP3R1 在顆粒細胞、卵丘細胞與卵母細胞中表達,IP3R1 鈣庫被動員后釋放鈣離子,導致胞內鈣離子水平升高,使NPR2 失活,本研究發現IP3R1 在顆粒細胞中的表達豐度也比較高,可能是除了NPR2 主要在卵丘細胞外,也表達于顆粒細胞[20]。 上述結果綜合提示PLCγ1 通過IP3R1 升高卵丘細胞內鈣離子水平,但IP3R1 究竟通過怎樣的機制調控卵丘細胞內鈣離子水平還需要進一步研究。

綜上所述,本研究證實了LH/EGFR 信號通過PLCγ1-IP3R1 通路升高卵丘細胞內鈣離子水平,使NPR2 失活,cGMP 水平下降,誘導卵母細胞減數分裂恢復。

致謝感謝中國農業大學生物學院張美佳教授提供實驗場所,感謝張美佳教授在論文寫作過程中給予的指導,感謝中國科學院動物研究所唐鐵山教授贈予抗體。