基于ARE-Nrf2 的皮膚致敏體外檢測方法及其在樣品檢測中的應用

劉春鳳,張麗婷,李小林,施 鎮,張子龍,李 健,陳 田?,邱 璐?

(1.上海海關動植物與食品檢驗檢疫技術中心,上海 200135; 2.上海家化聯合股份有限公司啟初研究中心,上海 200082; 3.上海國際旅行衛生保健中心,上海 200335)

由皮膚過敏引起的過敏性皮炎占皮膚相關疾病的15%～20%[1],因此對接觸皮膚的化學品及化妝品進行過敏性測試是安全性評價的重要項目。 現在大部分皮膚致敏測試仍然依賴于動物測試,小鼠局部淋巴結檢測(LLNA)作為一種替代方法,以淋巴結的T細胞增殖定量測定代替皮膚臨床癥狀觀察[2],可以減少實驗動物的使用量,可取代傳統動物實驗：豚鼠的經典方法、幾內亞豬最大化試驗(GPMT)和Buehler試驗(OECD TG 406),但沒有實現完全替代。 隨著2013 年歐盟相關法規實驗動物禁令的推行[3-5],樣品檢測對體外方法的需求越來越多。

致敏檢測體外方法的研發基于有害結局路徑(Adverse Outcome Pathway,AOP)的概念,將皮膚致敏的過程分為四個關鍵事件,基于每一個關鍵事件的分子起始事件都有對應的體外測試方法被開發,有些已被列入世界經濟合作和發展組織(OECD)測試指南TG442,如直接多肽反應試驗(direct peptide reactivity assay,DPRA)[6]、ARE-Nrf2 熒光素酶方法[7]、人細胞系活化實驗(human cell line activation test, h-CLAT)[8]等。

ARE-Nrf2(antioxidant responsive element-NF-E2-related factor 2)熒光素酶方法是針對角質形成細胞的活化的關鍵事件建立的體外替代方法,目前OECD 收錄的有KeratinoSensTM以及LuSens。 它的原理是：Keap1-Nrf2-ARE 信號通路可以通過控制抗氧化酶或者蛋白的表達來保護細胞不受氧化應激的損傷,該信號通路可以被皮膚致敏物激活。 目前ARE-Nrf2 熒光素酶方法只用于對單一化學物進行檢測。 我國的化妝品監管為成品監管,因此探索體外的方法在化妝品成品檢測中的應用對我們的化妝品檢測有更為重要的意義。 本研究旨在建立ARE-Nrf2 熒光素酶方法,并探索本方法對成品檢測的可行性。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級BALB/c 小鼠,雌性,8 ～12 周齡(18 ～22 g),44 只,由上海杰思捷實驗動物有限公司提供[SCXK(滬) 2018-0004]。 動物實驗在上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心[SYXK(滬) 2014-0020]進行,動物實驗環境條件為屏障系統動物房,溫度18℃～22℃,濕度40%～65%,自由飲食,12 h 人工照明。 該實驗研究由上海出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢驗檢疫技術中心實驗動物倫理委員會批準( IACUC 號：SHCIQAFTC-M015),并遵照動物實驗3R 原則在飼養和實驗過程中給予了恰當的人道關懷。

1.1.2 細胞

人永生化表皮細胞HaCaT 細胞購于北納生物。

1.2 主要試劑與儀器

DMEM 培養基、胎牛血清(FBS)(56℃加熱滅活30 min)、0.25%胰酶/EDTA 溶液(Trypsin/EDTA)、青霉素/鏈霉素雙抗、磷酸鹽緩沖液(DPBS)、遺傳霉素G-418、TRIzol plus RNA 純化試劑盒及cDNA反轉錄試劑盒(賽默飛,美國);二甲基亞砜(DMSO)(西格瑪奧德里奇,美國);熒光素酶檢測試劑盒(珀金埃爾默, 美國);CCK-8 試劑(株式會社同仁化學研究所,日本);無菌離心管、細胞培養瓶及培養板(25 cm2、75 cm2培養瓶、96 孔平底細胞培養板)(康寧,美國);SRBR Green 染料(海方生物,中國)。 水楊酸(CAS：69-72-7)、乳酸(CAS：50-21-5)、甘油(CAS：56-81-5)、SDS(CAS：151-21-3)、1-丁醇(CAS：71-36-3)、異丙醇(CAS：67-63-0)、肉桂醛(CAS：104-55-2)、二甲基丙烯酸二醇酯(CAS：97-90-5)、肉桂醇(CAS：104-54-1)、2-巰基苯并噻唑(CAS：149-30-4)、4-甲氨基苯酚硫酸鹽(CAS：55-55-0)、2,4-二硝基氯苯(CAS：97-00-7)、對苯醌(CAS：106-51-4)、甲醛(CAS：50-00-0)、間苯二酚(CAS：108-46-3)、芐基溴(CAS：10039-0)均購自Sigma 公司。

待測樣品：某品牌抗菌洗衣液、瞬清亮彩洗衣液、瞬清無磷洗衣液、自制化妝水配方、市售某品牌化妝水、市售化妝水添加50%肉桂醇。

II 級生物安全柜(Labconco,美國);二氧化碳培養箱(Thermo,美國);熒光讀板機(Perkin Elmer,美國);全波長酶標儀(BioTek,美國);細胞計數儀(Orflo,美國);離心機(Thermo,美國);細胞凍存盒(康寧,美國)(Coolcell);倒置顯微鏡(徠卡,德國);PCR 儀(ABI,美國);實時定量PCR 儀(ABI,美國);DNA 電泳儀(伯樂,美國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養方法

HaCaT 細胞及穩轉細胞株均在含10%胎牛血清(FBS) 的DMEM (Dulbecco’ s modified eagle medium)培養基中于5% CO2,37℃細胞培養箱內常規培養。

1.3.2 質粒構建及穩轉細胞株篩選

細胞株的構建參見Emter 等人的方法[9],PGL4.17 質粒從Promega 購得,在KpnI 和HindIII酶切位點之間插入人工合成的含有人AKR1C2-ARE 和SV40 啟動子的序列5’-GGTACCTGGTCGC AAGGTGTGCAAGCTGCTGAGTCACCCTGACTGCATC AACCCCAGGAGCTAGATCTGCGATCTGCATCTCAAT TAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCC ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCT CCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAG AGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAG AAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTT TGCAAAAAGCTT-3’, 構 建 成 功 的 pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40 質粒含有熒光素酶基因以及neor基因,可以用于穩轉細胞株的篩選。 使用Nucleofector 系統(Lonza)用程序U-020 轉染HaCaT細胞。 使用含有500 μg/mL G-418 的培養基來篩選穩定的克隆,分離、擴增單克隆細胞,篩選到的穩定生長的克隆進行PCR 及熒光素酶鑒定及細胞凍存。1.3.3 聚合酶鏈式反應(PCR)及實時定量PCR鑒定

熒 光 素 酶 的 引 物 序 列： 正 向 引 物 5’-ACGCACATATCGAGGTGGAC-3’, 反 向 引 物 5’-TGCTTTGGAAGCCCTGGTAG-3’,β 肌動蛋白的引物序列：正向引物5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’,反向引物：5’-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’。正常生長的細胞使用TRIzol 法進行RNA 的提取,反轉錄得到cDNA,PCR 體系為20 μL,含有4 μL cDNA、4 μL ddH2O、1 μL 正向引物(10 μmol/L)、1 μL反向引物(10 μmol/L)和10 μL 2×Taq mix,放到PCR 中,運行以下程序95℃5 min, 95℃15 s,55℃30 s,68℃30 s,后面三步35 個循環,將所得PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳。 熒光定量PCR 體系為 20 μL, 含 有 4 μL cDNA、 0.4 μL ROX referencedye2、4.6 μL ddH2O、 0.5 μL 引 物(10 μmol/L)和10 μL SYBR green mix。 均勻地加到96孔板中,每個樣品三個復孔,將96 孔板放到7500 Fast Real-Time PCR System (ABI)儀器中,運行以下程序95℃5 min, 95℃15 s, 60℃1 min,后面兩步40 個循環。 數據通過β 肌動蛋白進行歸一化。

1.3.4 受試物暴露

將測試化學物以200 mmol/L 的濃度溶解在去離子水中,不溶于水的溶于DMSO 中。 將化學物在溶劑中按2 倍稀釋系數稀釋8 個濃度,配成100 倍母液。 將DSens 細胞接種在96 孔板中(100 μL 不含G418 的生長培養基)。 24 h 后,進行化學物暴露,化學物用含有1% FBS 的100 μL 新鮮培養基稀釋到終濃度,溶劑的最終濃度為1%。 在每個實驗中,在所有8 種濃度下都有6 個復孔,每個板含有細胞和溶劑的對照孔。 孵育48 h 后,去除測試化學物,用DPBS 洗滌細胞一次,加入100 μL 細胞裂解液,1 min 后轉移到檢測用白板,使用熒光讀板機進行讀數。 對于細胞活力測定,孵育48 h 后,去除測試化學物,用DPBS 洗滌細胞一次,加入100 μL 新鮮培養基,向每個孔中加入10 μL CCK8 溶液,溫育1～3 h 后,450 nm 測光吸收。

1.3.5 LLNA：BrdU-ELISA 實驗方法

雌性BALB/c 小鼠隨機分組,每組4 只小鼠,樣品連續3 d 涂抹于小鼠雙耳背,第5 天腹腔注射BrdU標記液,第6 天摘取小鼠耳部淋巴結,制備淋巴細胞懸液,采用ELISA 法測定BrdU 摻入細胞的水平。

1.3.6 結果分析

(1)誘導倍數計算

誘導倍數(I)= (L 受試物-L 空白)/(L 溶劑-L空白)

式中：

L 受試物—— 受試物熒光讀數;

L 空白—— 空白(不含細胞不含受試物)熒光讀數;

L 溶劑—— 溶劑對照(陰性對照)熒光讀數均值。

(2)EC1.5 計算

EC1.5=(Cb-Ca)×((1.5-Ia)/(Ib-Ia))+Ca

式中：

Ca —— 誘導值大于1.5 時的受試物最低濃度,μmol/L;

Cb —— 誘導值小于1.5 時的受試物最高濃度,μmol/L;

La —— 大于1.5 時受試物最低濃度對應的誘導值(平行均值);

Lb —— 小于1.5 時受試物最高濃度對應的誘導值(平行均值)。

(3)細胞活性計算

細胞活性=(V 受試物-V 空白)/(V 溶劑-V 空白)×100

式中：

V 受試物—— 受試物的吸收值;

V 空白—— 空白(不含細胞不加受試物)的吸收值;

V 溶劑—— 溶劑對照的吸收均值。

(4)ICx 計算

ICx=(Cb-Ca)×((100-x)-Va)/(Vb-Va)+Ca

式中：

X —— 要計算的抑制率百分比(%,如IC50 或者IC30)

Ca —— 抑制率大于x%的最低濃度,μmol/L;

Cb —— 抑制率小于x%的最高濃度,μmol/L;

Va —— 抑制率大于x%的最低濃度下的細胞活率(%);

Vb —— 抑制率小于x%的最高濃度下的細胞活率(%)。

(5)結果判斷：

a.對于任何一個結果的判定都要經過至少兩次獨立的實驗,每次實驗至少三個平行,如果兩次結果不一致,則應進行第三次實驗。 實驗應在不同的時間,所用受試物必須新鮮配制。

b.陽性結果的判定：兩次或三次實驗的結果都滿足以下四條,則被預測為陽性結果,否則為陰性。

i.受試物的最大誘導倍數Imax 大于等于1.5,與對照相比有顯著性差異(t-test);

ii.EC1.5 濃度下細胞的存活率大于70%;

iii.EC1.5 濃度小于1000 μmol/L,或者未確定分子量的受試物小于200 μg/mL;

iv.熒光素酶誘導有明顯的劑量依賴性增加。

如果在給定的重復中,所有三個第一條件都得到滿足,但不能觀察到熒光素酶誘導的明顯劑量依賴性的增加,那么這種重復的結果應該被認為是不確定的,可能需要進一步的測試。 此外,在最大試驗濃度＜1000 μmol/L (或對未確定分子量的試驗化學品為200 μg/mL)且在最高試驗濃度時細胞活力＜70%活力的受試物所獲得的陰性結果也應視為非決定性結果。

1.4 統計學分析

2 結果

皮膚致敏劑可作用于傳感器蛋白Keap1,從而使其與核轉錄因子Nrf2 解離,解離的Nrf2 可以激活多種抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶基因的轉錄[10]。 我們通過轉染pGL4.17-AKR1C2-ARE-SV40 質粒構建的穩轉細胞株,熒光素酶信號反映了內源性Nrf2 依賴基因的致敏物激活狀態,此方法可以通過定量檢測由Keap1-Nrf2-ARE 反應通路激活引起的熒光素酶基因表達情況,作為皮膚致敏的反應量化指標。本研究是基于OECD TG 442D 測試指南進行[7],但是穩轉細胞株是由我們自己構建,因此需要進行驗證是否與商品化KeratinoSensTM細胞株有一致的作用條件,以及對指南中的參考物質是否具有很好的檢測能力。

2.1 穩轉細胞株的鑒定

將G-418 篩選出的兩株可以正常生長的細胞株(標記為DSens-1,DSens-2)進行PCR 鑒定,如圖1A所示,只有DSens-1 有熒光素酶的表達,而野生型的HaCaT 細胞跟DSens-2 都是陰性的結果,因此DSens-1 為陽性細胞株(以后稱DSens)。 將PCR 鑒定出的陽性穩轉細胞株DSens 進行陽性物質肉桂醛(CAS：104-55-2)測試,檢測該細胞株是否對肉桂醛有劑量效應。 結果表明肉桂醛濃度與熒光素酶的表達量有明顯的量效關系(圖1B),表明穩轉細胞株的構建是成功的。

2.2 DSens 實驗條件確定

我們的操作規程參照了OECD TG 442D 測試指南,但是由于使用的穩轉細胞株發生了改變,因此需要確定最佳的實驗條件。 首先進行鋪板密度的確認：將細胞以不同的數量接種到96 孔板(0.0625-6×104個細胞/孔),使用64 μmol/L 的肉桂醛暴露48 h,檢測肉桂醛的最大誘導倍數,結果如圖2A 所示,64 μmol/L 肉桂醛的誘導倍數在接種量大于1×104個細胞/孔時在2 ～8 之間,并且,接種量在1×104個細胞/孔時,誘導倍數最大,表明在此細胞密度下檢測的敏感性最高。 這個結果與KeratinoSensTM的推薦實驗條件是一致的,并且數值符合KeratinoSensTM可接受的標準。 其次,熒光素酶試劑盒確認：我們使用了輝光型的熒光素酶試劑盒而非瞬時發光的熒光素酶試劑盒,雖然的熒光衰減隨時間較為緩慢,但是不清楚是否會對最終的結果判定產生影響。 為了確定在加入裂解液之后的不同時間讀取數值對最終結果判定的影響,我們對同一樣品進行不同時間點的數據讀取,結果顯示,隨著時間的延長,樣品的熒光強度會緩慢下降(圖2B),但是對數據處理后的EC1.5 影響不大(表1),不會影響到對結果的判定。

圖1 穩轉細胞株的鑒定Figure 1 Identification of the stably transfected cell line

圖2 細胞數量及數據讀取時間對DSens 實驗的影響Figure 2 Effects of DSens cell number and data reading time on the DSens cell experiment

表1 根據圖2B 的數據計算的肉桂醛的EC1.5Table 1 EC1.5 of cinnamaldehyde calculated according the date in Figure2B

2.3 化學物樣品檢測

本研究共對16 種化學物進行檢測,包括OECD 指南推薦的10 種化學物和6 種自選化學物(表2)。 從結果可以看出,DSens 對OECD 指南推薦的10 種化學物的預測與KeratinoSensTM預測結果一致[7],并與LLNA 的結果相符[11]。 從EC1. 5 的數值來看,10 種化合物都在OECD 指南的參考范圍內。 6 種自選化學物的結果也與LLNA 的結果一致[11],其中SDS 是典型的具有刺激性但無致敏性的物質,DSens 對其檢測結果沒有出現假陽性。 KeratinoSensTM對間苯二酚的檢測出現假陰性的結果[9],但是DSens 給出了與LLNA 一致的陽性預測。

2.4 混合物樣品檢測

KeratinoSensTM的方法因為缺乏動物實驗的驗證而不能確定其在混合物檢測中的準確性,DSens 方法也存在同樣的問題,因此我們在混合物樣品的選取上盡量選擇已知檢測結果的樣品以便進行結果的驗證。 混合物樣品濃度按照未知分子量的物質來設置,最高濃度為200 μg/mL。 洗衣液樣品的LLNA：BrdU-ELISA 的預測結果如表3 顯示,樣品組不同濃度組的SI 與對照組相比沒有顯著性差異,預測結果為陰性。 表4 結果顯示：三個洗衣液的樣品暴露的DSens 細胞中熒光素酶基因的表達沒有被激活,在設置的一系列濃度中最大誘導倍數Imax 沒有大于1.5 的數值,DSens 預測為陰性,與LLNA：BrdU-ELISA 的預測結果一致(表3);自制化妝水中的肉桂醛是化妝品中可以添加的香料致敏物,但其濃度超過限度可能會引起致敏反應,DSens 結果顯示樣品的EC1.5 為(82.43±13.36)μg/mL＜200 μg/mL,預測為陽性,與DPRA 結果一致(多肽平均消除率為13.98%)[12];某品牌化妝水在實驗濃度范圍內最大誘導倍數Imax 沒有大于1.5 的數值,預測為陰性,與人體斑貼試驗結果一致;組合化妝水中添加了50%的肉桂醇,肉桂醇是一種弱致敏物,廣泛應用于食品香精及化妝品香精中, DSens 結果顯示樣品的EC1.5 為(90.52±13.31)μg/mL＜200 μg/mL,預測為陽性。 總體樣品的檢測結果顯示,6 種樣品的預測結果與已知的結果一致,預測成功率100%,并且能夠預測出過量添加的弱致敏物,說明DSens方法具有對混合物樣品進行預測的潛力,為化妝品成品或者日用化學品的致敏檢測提供有價值的參考。

表2 DSens 結果與KeratinoSensTM及LLNA 結果比較Table 2 Comparison of results of DSens Prediction, with that of KeratinoSensTM Prediction and LLNA Prediction

表3 洗衣液樣品LLNA：BrdU-ELISA 檢測結果Table 3 Laundry samples LLNA： BrdU-ELISA test results

表4 混合物樣品DSen 細胞預測結果與其他預測結果比較Table 4 Comparison of the prediction results of mixture products obtained by DSens method and the results of other prediction test methods

3 討論

物質的致敏性預測作為最重要的安全性評價項目之一,對體外方法的需求非常高,但是由于致敏反應的復雜性,單靠一種體外方法難以對物質的致敏性進行準確的判斷,因此多種體外檢測方法的組合運用,可以提高檢測的準確率。 體外檢測方法,尤其是組合方法的運用,可以幫助我們找到優化的實驗動物的替代方案,更好的服務于國內的化妝品企業及原料商。 目前商品化的KeratinoSensTM在國內的轉移轉化存在諸多困難,DSens 方法是國內建立的ARE-Nrf2 熒光素酶方法,它可以彌補國內這一方法的空缺,為國內的體外致敏檢測方法提供的更多的選擇,也為體外組合方法提供了更多的可能性。

本研究使用OECD TG 442D 測試指南推薦的10 種化學物對該方法進行了成功的驗證,這顯示該方法的可靠性,可以作為進一步研究和推廣應用的基礎。 此外,我們另外選取了6 種化學物,其結果與Emter 等[9]人的文章中的數據進行的比對,發現DSens 對間苯二酚的檢測結果為致敏陽性,與人體試驗和LLNA 結果相符,并沒有出現KeratinoSensTM的 假 陰 性 結 果。 這 也 顯 示 出 DSens 與KeratinoSensTM方法雖然采用了相同的技術手段,兩者之間也存在細微的差異。 但這種差異性產生的原因還不清楚,一種可能的原因由于外源基因插入基因組位置的不同導致穩轉細胞株存在一定的差異性,這使得Dsens 對酚類物質的預測不會出現假陰性的結果,當然要證實這一點,我們還需要去驗證更多化學物如丁香酚、二氫丁香酚等,這值得我們去進一步的討論和研究。

本研究采用DSens 方法對混合物樣品進行致敏性檢測,并與其他檢測方法的預測結果進行比較,取得了一致的結果,表明了DSens 方法具有用于產品致敏預測的潛力。 由于我國對產品安全性的監控采用成品測試的方法,DSens 對成品的預測潛力可以為企業研發產品測試提供新的可能。 未來將嘗試建立以ARE-Nrf2 熒光素酶方法為基礎的系列體外檢測方法,可用于可溶性混合物成品如：化妝水、乳液、洗護產品、植物提取物及日用化學品等樣品檢測。