IGF-1 上調miR-155 表達對新生大鼠缺氧性肺動脈高壓肺組織損傷的影響及其作用機制

于秀石,朱 佳,魏麗麗,馬克濤,司軍強,張忠雙,3?,田俊杰,羅 淑,魯廣森

(1.石河子大學醫學院,新疆 石河子 832000; 2.新疆維吾爾自治區人民醫院,烏魯木齊 830000;3.石河子大學新疆地方與民族高發病教育部重點實驗室,新疆 石河子 832000)

新生兒缺氧性肺動脈高壓(hypoxia-induced pulmonary hypertension, HPH)是常見的威脅新生兒生命的急危重癥,疾病早期表現為肺血管痙攣,若及時發現并進行治療則可抑制血管痙攣,否則疾病發展到晚期則表現為肺血管重塑,發生不可逆的組織變化,此時期救治困難、死亡率高[1-2]。 目前其發病機制尚不清楚,已知血管舒縮因子的平衡失調在發病過程中起了重要作用[3-4]。 在HPH 的發病機制研究發現缺氧誘導因子1α (hypoxia-inducible factor 1α, HIF-1α)和內皮素-1(endothelin-1, ET-1)的上游調節因子,參與HPH 的發生與發展[5]。miR-155 屬于小分子RNA,能通過與靶基因3’或5’非編碼區(untranslated region, UTR)的結合,調控靶基因的表達,參與機體的各種生物調控過程,如miR-155 在抑郁癥患者的血漿中的表達與多種炎癥因子相關。 胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor1, IGF-1)能有效促進外周神經再生,具有非選擇性神經營養作用,已有動物實驗研究發現新生大鼠缺氧缺血性腦損傷后腦室內給予IGF-1,明顯減輕腦損傷區的神經元缺失[6]。 在研究對HPH 的機制時,IGF-1 上調miR-155 表達的作用非常重要,但miR-155 在肺損傷中的作用鮮有報道[7];且國內尚無新生兒HPH 發生與IGF-1 相關的研究。 故而本研究通過建立HPH 新生大鼠模型,以尼莫地平為工具藥,探索在HPH 發病過程中,IGF-1 的作用機制,HIF-1α 和ET-1 的生理功能,現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級Wistar 大鼠180 只,雌雄不限,日齡3 ～5 d (大鼠新生兒期),體質量(20 ± 5) g,購自海軍軍醫大學動物中心,實驗動物生產許可證號[SCXK(滬)2019-0009]。 依據應用實驗動物的3R 原則給予適當關照。 飼養及無菌手術在復旦大學醫學院實驗動物科學部屏障動物實驗設施進行[SYXK(滬)2019-0026],置于全自動調節低壓艙,飼養條件：室溫21℃～25℃,相對濕度50%～65%,光暗循環12 h/12 h,自由飲水攝食。 實驗動物福利倫理審查號：2019012304。

1.2 主要試劑與儀器

尼莫地平(國藥準字H43020645,規格：每片30 mg,湖南百草制藥有限公司);鼠源性單克隆抗體(Anti-β-actin)(美國Amgen 公司);ELISA 試劑盒(美國R&D 公司);BCA 蛋白定量試劑盒(BCA protein assay kit)(美國BioVision 公司);TaqMan?MicroRNA Reverse Transcription kit 試劑盒(美國ABI 公司);Gel-Doc 凝膠成像分析系統(美國UVP公司);Leica Qwin 圖像分析系統(德國Leica 公司); NanoDrop 2000 蛋白/核酸分析儀(美國ThermoFisher 公司);高速離心機(美國Beckman 公司);LightCycler480 高通量實時熒光定量PCR 儀(美國羅氏公司);TRIzol 裂解液(美國Invitrogen 公司)和RNase-free 水(美國ThermoFisher 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

新生大鼠均適應性飼養1 周,隨機分成3 組：模型組、給藥組及空白對照組。 將模型組和給藥組新生大鼠置于自制全自動調節常壓低氧艙內(大氣壓約50 kPa,氧濃度10%),制造間斷性低氧環境,以1.5 L/min 的速度輸入含10%的氮氧混合氣,予以氧濃度儀監測,維持氧濃度在9.5%～10.5%范圍內,控制二氧化碳濃度小于0.5%。 通過放置小風扇維持低氧艙倉內氣體均勻,通過減壓閥和電磁閥調節艙內壓力,予以無水氯化鈣、鈉石灰吸收箱內的水蒸氣與二氧化碳。 晝/夜為12/12,每天缺氧8 h,連續2 周。 分別于缺氧2、4、8、12 d 檢測肺動脈平均壓(mean pulmonary arterial pressure, mPAP),mPAP≥6.5 pg/mL,且具有較強時間依賴性,則證明成功建立HPH 大鼠模型[8]。 缺氧同時給藥,其中給藥組每天灌胃給予3 mg/kg 尼莫地平。 空白對照組除不低氧,即大氣壓約50 kPa,氧濃度10%,其余條件相同,兩組大鼠放于同一房間以相同飲食飼養,模型組及空白對照組每天灌胃給予生理鹽水。分別于缺氧2、4、8、12 d 依照隨機數字表法抽取模型組、給藥組及空白對照組大鼠各10 只進行相關檢測指標的監測。

1.3.2 mPAP 檢測

各組大鼠在被觀測時間點經氯胺酮腹腔內注射麻醉后,固定實驗大鼠,消毒頸、胸部皮膚,行氣管插管,給予機械通氣,潮氣量：2 ～3 mL/min,監測新生大鼠尾部血氧飽和度(pulse oxygen saturation,SpOb),使其維持在(90 ± 5)%。 開胸,朝著血流的反方向將彎形頭皮針一端緩慢扎進肺動脈根部,頭皮針另一端通過壓力傳感器連接生理通道記錄儀。對肺動脈壓力曲線進行記錄。

1.3.3 肺損傷組織病理形態學觀察

于缺氧12 d 給藥后2 h,處死大鼠,取肺部組織,4%甲醛固定,脫水進行石蠟包埋,4 μm 進行組織切片,二甲苯脫臘,蘇木精染,伊紅乙醇染色,二甲苯處理,中性樹脂進行封膠固定,烘箱過夜處理,光鏡下觀察肺組織切片病理學變化。

1.3.4 Western blot 法檢測HIF-1α 和ET-1 在肺組織的表達

取“1.3.2”項下大鼠肺部組織,提取總蛋白,蛋白變性緩沖液變性,在硝酸纖維素膜上放置12.5%SDS-PAGE 膠轉膜后,3% BSA 4℃封閉過夜,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜,分別摻入HIF-1α 和ET-1單克隆抗體(1 ∶500),在室溫下孵化45 min,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜。 二抗孵育,摻入HRP 標記的二抗(1 ∶1000),室溫孵化30 min,PBS 緩沖液洗滌硝酸纖維素膜,ECL 發光并成像,以β-actin 作為內參,檢測HIF-1α 各組的相對表達,檢測肺部組織中的ET-1 蛋白的相對表達量。 采用顯微成像系統進行拍照,并對圖片使用Image Pro Plus 6.0 進行處理分析,將染色陽性顆粒的灰度單位轉換為吸光單位,并測量其密度(optical density,OD)值,以此作為其陽性表達的半定量。

1.3.5 ELISA 法檢測血清中HIF-1α 與ET-1 的表達

各組大鼠于觀察時間點采靜脈血0.5～1.0 mL,3000 r/min 離心15 min,提取上清液,置離心管置于-20℃冰箱備用。 使用ELISA 試劑盒,嚴格按照說明書操作,計算血清HIF-1α 與ET-1 的含量。

1.3.6 定量PCR 檢測肺組織的miR-155 mRNA表達

取出大鼠肺部組織研磨,加入1 mL TRIzol 裂解液,室溫靜置5 min,加入200 μL 氯仿混勻,室溫放置10 min。 離心取上層,加入等體積異丙醇于RNase-free 的1.5 mL 離心管中,冰浴30 min,在4℃,12 000 r/min 離心15 min,得到RNA 沉淀,空氣干燥RNA。 加入50 μL RNase-free 的水溶解RNA;利用NanoDrop 測定總抽提RNA,置于-20℃,備用。根據TaqMan? MicroRNA Reverse Transcription kit試劑盒操作說明書,cDNA 產物由抽提的RNA 體外反轉錄實驗得到;在16℃中孵化需要30 min;在42℃中孵化需要30 min;85℃加熱5 min,4℃保存。通過得到的cDNA 進行PCR 熒光定量檢測,在LightCycler480 儀器上操作,以U6 為內參,miR-155的相對表達用ΔCT 來表示,95℃,預變性10 min,95℃15 s,60℃30 s,70℃30 s,共40 個擴增周期,ΔCT=CTU6-CTmiR-155計算miR-155 mRNA 的相對表達,引物信息見表1。

1.4 統計學分析

本研究中數據使用SPSS 22.0 進行分析,采用單因素方差分析計量資料以平均數±標準差(±s)表示,組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗,以P＜0.05 認為差異有顯著性。

2 結果

2.1 各組大鼠的一般狀況比較

模型組大鼠反應遲鈍,虛弱,體毛暗淡,蜷縮少動,精神萎靡,食量減少和體重下降等;空白對照組大鼠反應敏捷,體毛光澤,飲食和體重正常;給藥組大鼠的反應、體毛、飲食和體重介于空白對照組和模型組。

2.2 各組大鼠不同時間段mPAP 比較

與空白對照組比,模型組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 顯著降低(P＜0.05),見表2。

2.3 各組大鼠肺組織HE 染色

空白對照組肺組織結構清晰可見,間質無滲出,無炎癥細胞浸潤,肺泡腔內未發生水腫液與出血,肺泡壁完整;模型組肺微血管擴張充血,雙肺體積增大,明顯肺水腫,大量紅細胞與液體從肺泡腔及肺泡隔內滲出,可見浸潤的炎癥細胞,偶然形成透明膜,大小各異的肺泡,肺泡間隔明顯增厚;給藥組大鼠其肺組織肺泡腔滲出、出血,毛細血管擴張開并充血,較模型組炎癥細胞浸潤明顯減輕,見圖1。

2.4 不同時間段各組大鼠血清中HIF-1α 與ET-1水平比較

與空白對照組比,模型組大鼠缺氧2 d、4 d、8 d 和12 d 的HIF-1α 和ET-1 均顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的HIF-1α 和ET-1均顯著降低(P＜0.05),見表3 和表4。

2.5 各組大鼠肺組織ET-1 蛋白表達檢測

與空白對照組比,模型組大鼠缺氧12 d 肺組織的HIF-1α 和ET-1 蛋白表達均顯著增高(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧12 d 肺組織的HIF-1α和ET-1 蛋白表達均顯著降低(P＜0.05),見圖2 和表5。

表1 各引物序列信息Table 1 Primer sequence information

表2 各組大鼠不同時間段mPAP 比較(n=10)Table 2 Comparison of mPAP in the rats of different groups at different time of treatment (n=10)

圖1 各組大鼠肺組織的病理學改變Figure 1 Pathological changes in the lung tissues of rats in the three groups

表3 不同時間段各組大鼠血清中HIF-1α 水平比較(n=10)Table 3 Comparison of the serum HIF-1α levels at different times of rats in the three groups (n=10)

表4 不同時間段各組大鼠血清中ET-1 水平比較(n=10)Table 4 Comparison of serum ET-1 levels at different times of rats in the three groups (n=10)

圖2 Western blot 檢測大鼠肺部組織中HIF-1α 與ET-1 的表達Figure 2 Western blot detection of the ET-1 expression in the rat lung tissues

表5 Western blot 檢測大鼠肺部組織中HIF-1α 與ET-1 的表達(n=10)Table 5 Western blot detection of ET-1 expression in lung tissues of rats in the three groups (n=10)

2.6 各組大鼠肺組織miR-155 表達比較

與空白對照組比,模型組大鼠缺氧12 d 肺組織的miR-155 表達顯著降低(P＜0.05),與模型組比,給藥組大鼠缺氧12 d 肺組織的miR-155 表達顯著增高(P＜0.05)。 進一步從TargetScan 網站對miR-155 的靶基因進行預測發現,其與HIF-1α 的5’UTR 配對互補,說明miR-155 可能是通過靶向結合HIF-1α 3’ UTR 調控其在肺組織中的表達水平。 見圖3 和表6。

圖3 各組大鼠肺組織miR-155 表達比較(n=10)Figure 3 Comparison of expression of microRNA-155 in lung tissue of rats in the three groups (n=10)

3 討論

3.1 HPH 的發病機制及病理生理

HPH 的相關研究認為肺動脈高壓的起始環節為缺氧所致肺微小動脈內皮損傷,細胞因子與血管活性物質產生及異常釋放的原因為血管內皮受損導致功能失調引起[9]。 作用于血管平滑肌的血管舒縮因子平衡失調,出現肺血管收縮為早期表現,出現HPH,肺血管重建及肺血管壁病理改變為HPH后期表現[10]。 其中越來越受到關注的為HIF-1α 的作用[11],生理活性由α 亞基的表達和活性決定的氧依賴轉錄激活因子,是在缺氧條件下誘導產生的、在體內許多細胞中廣泛存在的。 HIF-1α 是介導機體對缺氧發生基因表達重新調整、肺血管收縮、肺血管重塑形成的中心環節,在HPH 的發生過程中起著非常重要的作用[12]。 有研究表明缺氧早期低氧刺激肺組織產生大量HIF-1α,由于缺氧耐受效應使得肺組織HIF-1α[13]表達隨著缺氧時間延長不再明顯提高。 本研究表明,在HPH 大鼠模型中,早期缺氧刺激能顯著提高HIF-1α 的表達,而在缺氧后8 d和12 d 雖然也有增加,但HIF-1α 的表達相比于前期無顯著變化。

ET-1 是內源性血管收縮因子,肺部是ET-1 作用和代謝的最重要臟器[14]。 ET-1 可能是促使肺血管強烈收縮導致肺動脈高壓發生過程中的一個重要因素[15]。 本次研究結果表明,在模型組新生大鼠缺氧2 d 起血清ET-1 即明顯增高,并持續至12 d,同時在模型組大鼠肺組織中ET-1 蛋白也存在著顯著高表達。 其原因可能為：在缺氧早期血管內皮細胞在低氧刺激下產生大量HIF-1α,HIF-1α 誘導下游靶基因ET-1 高表達。 肺血管內皮細胞膜上ET-B受體與通過自分泌途徑異常升高的ET-1 相結合,生成大量氧自由基,對肺動脈高壓損傷程度加重與肺血管內皮細胞本身的脂質造成過氧化損害[16]。?

表6 miR-155 靶基因預測結果Table 6 Predictive results of target genes for microRNA-155

3.2 IGF-1 上調miR-155 表達對HPH 的作用

IGF-1 作為體內重要的生長因子,對細胞的增殖、分化、凋亡及機體的生長發育起重要調節作用[17-18];已有相關研究報道稱IGF-1 可防治高氧肺損傷[19-20]。 在對HPH 大鼠模型進行現非侵入性鼻腔滴入IGF-1 后發現,肺部組織損傷明顯降低,說明入IGF-1 對大鼠低氧肺動脈高壓肺組織損傷有保護作用。 通過檢測給藥組大鼠肺組織HIF-1α 以及ET-1 的表達發現,其在肺組織中的表達水平得到了明顯的抑制,表明IGF-1 可能通過作用于HIF-1α,進而抑制ET-1 的表達,發揮對肺組織的保護作用[21]。

IGF-1R mRNA 可在大鼠肺小動脈壁上正常表達。 IGF-1 可特異結合細胞膜ICG-1R,傳導其刺激增殖信號,引發細胞增殖、細胞分化等效應。 ICG-1R 受激活后可影響大部分細胞的增殖和轉化過程,同時抑制細胞凋亡[22]。 本次研究表明,模型組大鼠缺氧2、4、8 和12 d 的mPAP 平均水平為均顯著高于空白對照組mPAP 對應時間的平均水平,各時間的差異均具有統計學意義,提示經低氧環境培養后,大鼠可產生低氧性肺血管重建和缺氧性肺動脈高壓。 Dogansen 等的研究[23]表明,肺動脈高壓的大鼠中,肺小動脈壁miR-155 水平明顯減少。 分析原因,在低氧性肺血管重建過程中, IGF-1R 不僅擔任受體角色,而且可引導肺血管平滑肌細胞從收縮表型轉化成合成表型,促進細胞增殖。 而血管壁結構構成與細胞增殖及凋亡相關。 綜上,IGF-1R 具有促進細胞增殖及抑制細胞凋亡的作用,因此有利于血管壁結構重建,而miR-155 是IGF-1R mRNA 中重要的抑制因子[24]。 因此,低氧條件時,肺小動脈壁miR-155 水平的降低與低氧性肺血管重建具有重要的關聯,適當提升其水平有利于改善HPH 病情[25]。

在分子水平上采用定量PCR 檢測肺組織中miR-155 的表達發現,與空白對照組大鼠比,模型組大鼠肺部組織中miR-155 表達明顯下降,差異具有顯著性。 與模型組大鼠比,IGF-1 給藥后大鼠肺組織中miR-155 表達的平均水平則明顯升高,差異有統計學意義。 對其靶基因進行預測分析發現,其可能通過靶向結合HIF-1α 5’UTR,調控其在肺組織中的表達。

低氧作為始動因素通過誘導HIF-1α 及其ET-1的表達,IGF-1R 具有促進細胞增殖及抑制細胞凋亡的作用,miR-155 對IGF-1R 的抑制作用減弱,導致肺血管收縮與增生異常,進而導致HPH 肺組織損傷。 IGF-1 可顯著上調肺組織中miR-155 的表達,降低IGF-1R 的細胞增殖作用并促進細胞凋亡,一定程度上保護肺組織損傷的發生,對臨床治療缺氧性肺動脈高壓引發的肺損傷提供理論依據。