人柯薩奇B2 病毒感染恒河猴模型的初步研究

段素琴,楊亞平,楊鳳梅,李艷艷,劉 權,趙 遠,馬紹輝,和占龍

(中國醫學科學院/北京協和醫學院 醫學生物學研究所, 云南省重大傳染病疫苗研發重點實驗室,昆明 650118)

近年來,手足口病(hand foot and mouth disease,HFMD)在亞太地區呈持續高發態勢,中國大陸每年發病數超百萬人,死亡近千人,已成為重要的公共衛 生 問 題[1]。 HFMD 主 要 是 由 腸 病 毒 71(Enterovirus 71,EV-71)、柯薩奇病毒A16(Coxsackie virus A16,CA16)和柯薩奇病毒A6(Coxsackie virus A6,CA6)引起的,但自2008 年以來,其他的柯薩奇病毒例如CV-B2、CV-B1 和CV-B4 等在手足口病人也經常被檢測并報道[2-3]。

人類柯薩奇B2 病毒(Coxsackie virus B2,CVB2),是一類無包膜,單股正鏈RNA 病毒,隸屬人類腸道病毒B 組。 該病毒感染后可能會發生HFMD、心肌炎、克山病和無菌的腦膜炎等疾病,特別是小于1 歲的嬰幼兒由于免疫功能相對不足,感染后病癥較為嚴重[4-6]。 據報道,我國早在1995 年山東就爆發了CV-B2 導致的病毒性腦膜炎的流行,在各省都有流行的相關的報道,并且臺灣省于1999、2002、2003 和2006 年CV-B2 的感染率均異常增高[7-8]。

據報道CV-B2 可以引發致命的心肌炎,但到目前為止針對CV-B2 病毒疫苗和藥物的研究和相關的動物模型未見詳細報道,尤其是非人靈長類動物模型[9]。 本研究旨在選擇與人最為接近的非人靈長類恒河猴嬰猴作為實驗模型進行人類柯薩奇B2病毒嬰猴感染模型的初步研究,為進一步研究該病毒引起HFMD 的發病機制、病理生理、藥物和疫苗的研發及評價等方面提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選取普通級標準、背景清晰、3 ～4 月齡,雄性5只恒河猴嬰猴,編號分別為18001、18003、18005、18007、18009,實驗前對所有動物進行CV-B2 病毒中和抗體檢測均為陰性,體重0.6 ～0.7 kg(誤差不大于10%),來源于中國醫學科學院醫學生物學研究所靈長類中心[SCXK(滇)K2015-0004];動物飼養于醫學生物學研究所實驗動物部[SYXK(滇)K2015-0006],光照12 h/d,溫度26℃～29℃,濕度40%～60%。 實驗前動物單籠隔離飼養適應兩周,每天飼喂4 餐,牛奶和蒸糕為主,輔助適量水果,自由飲水。 本實驗經中國醫學科學院醫學生物學研究所動物福利倫理委員會審查批準(批號：DWSP201810002),動物實驗房符合相關標準,實驗期間按實驗動物使用的3R 原則給予人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

CV-B2(RW41-2/YN/CHN/2012)保存于中國醫學科學院醫學生物學研究所遺傳室。

Takara PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2(日本);Tiangen 2 × Taq PCR Mastermix(中國);瓊脂糖(西班牙);Vivacell EcoDye DNA 染料核酸染料(美國)。

Sysmex XT-2000i 血細胞儀(日本希森美康);Mindray BS-2000 自動生化分析儀(中國邁瑞);Motic 顯微鏡及成像系統(中國);BioTeK 酶標儀(美國伯樂);Thermo 低溫高速離心機(美國); Bio-Rad PCR system(美國);立式高壓滅菌鍋(SX-500,日本Tomy 公司);制冰機(IMS-200,常熟雪科);海爾冰箱(BCD- 215KMLM);醫用低溫保存箱(DW -25L262,海爾);移液槍(Eppendorf,德國);槍頭(Axygen,美國);1.5 mL 離心管(Axygen,美國);福爾馬林(茂業試劑,中國);止血干棉花(中國);手術器械(中國);肛式體溫計(中國)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物感染及樣本采集

(1)結合人的腸道病毒的主要感染途徑,參考Chen 等[10]的EV71 建模方式,按照每只動物經口腔感染滴定毒株106TCID50/mL 的CV-B2。

(2)樣本采集：于感染后第0、1、2、3、4、5、7、11、14 天采集后肢靜脈血,抗凝血1 mL、非抗凝血2 mL。 采集感染后第3 天的皰疹組織浸泡于10%福爾馬林進行固定,并用無菌棉簽蘸取皰疹液保存于-80℃冰箱中。

1.3.2 臨床觀察和記錄

(1)第0 ～14 天,每天觀察3 次動物臨床癥狀,包括飲食量、活動度、精神狀態、皰疹、排便情況等,并進行標準評分記錄：正常-0;精神萎靡-1;弓背沉郁-2;活動減少-3;消瘦-4;四肢麻痹-5;瀕死或死亡-6;飲食量減少-7;皰疹-8。

(2)第0～14 天,每天早晨9：00 測量肛拭體溫。

1.3.3 指標檢測

(一)血細胞檢測和生化檢測

取抗凝血150 μL,按照操作說明測定血細胞。非抗凝血標本在4℃靜置半小時,待血清自然析出(無溶血現象),4℃,4000 r/min,離心10 min,輕輕吸出血清至1.5 mL 離心管中,及時對樣品進行生化指標(肝功、腎功、心肌酶)的檢測。

(二)血液和皰疹PCR 的鑒定

1.針對CV-B2(RW41-2/YN/CHN/2012)選擇保守序列作為靶基因,通過Primer Premier 5.0 軟件設計兩組巢式PCR 的引物(見表1),引物昆明碩勤技術服務有限公司合成。

2.用TRIzol 法提取感染后的皰疹液和血液的RNA,以提取的RNA 作為模板,通過巢式PCR 對血液和皰疹液中的病毒情況進行檢測。 首先,用TaKaRa 公司的PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2 試劑盒進行RT-PCR,反應體系為：PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1 μL,2 × 1 Step Buffer 10 μL,RNA 模板2 μL,F1 1 μL,R1 1 μL,ddH2O 5 μL。 反應條件為：50℃逆轉錄30 min,94℃預變性3 min,94℃變性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸1 min,34個循環后再72℃延伸7 min。 其次,進行二次PCR,反應體系為：2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL,F2 1 μL,R2 1 μL,RT-PCR 產物2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應條件為：94℃預變性3 min,94℃ 變性30 s,62℃退火30 s,72℃延伸40 s,34 個循環后再72℃延伸5 min。 最后,取5 μL 擴增產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳,根據DNA marker (DL 2000,TaKaRa)、陽性對照、陰性對照判定結果,用凝膠成像系統觀察條帶大小并拍照。 PCR 陽性擴增片段送昆明碩勤測序公司進行測序,通過與Genbank 中CV-B2 序列(RW41-2/YN/CHN/2012)進行比對以確定PCR檢測結果的準確性。

(三)組織病理將固定好的皰疹組織及時送昆明金裕醫學檢驗中心進行制片, HE 染色(hematoxylin-eosin staining),病理結果利用全自動病理圖文系統進行掃描觀察。

1.4 統計學分析

利用SPSS 統計學軟件,對數據計算均值,以平均值±標準差(±s)進行相關數據分析。

本實驗設計考慮實驗猴的倫理及研究成本等因素,設計為實驗前后對照方案,動物的體溫、血細胞、生化檢測指標均采取實驗前、實驗后數據。

2 結果

經口腔方式(消化道)感染恒河猴嬰猴后出現體溫升高,手、足、口、生殖器等部位出現皰疹,血象、心肌酶、肝功能和腎功能的改變,結合RT-PCR和病理結果可以確定恒河猴嬰猴感染CV-B2 后出現了典型的手足口病的癥狀。

2.1 臨床觀察記錄

恒河猴嬰猴感染CV-B2 后,每天對其進行臨床癥狀觀察,體溫呈現不規則熱型,低熱(38℃～39℃之間),感染第2、7、14 天略有上升(見圖1);在感染初期并沒有發生明顯的起伏變化,排便均正常。 在感染第2 天起5 只實驗猴均出現活動減少、精神低迷、飲食量減少等現象,未出現四肢麻痹和死亡;在感染第2 天開始,每只猴子均在不同時間點、不同部位出現手、足、口部皰疹,所有猴子咽部均出現約2～3 mm 大小的灰白色皰疹,周圍有紅暈,伴有充血情況,皰疹癥狀在3～5 d 不等全部消退(見圖2 和表2)。

表1 CV-B2 的特異性引物Table 1 Specific primers for CV-B2

圖1 恒河猴感染CV-B2 體溫變化情況Figure 1 Changes in body temperature of the rhesus monkeys infected with CV-B2

2.2 血細胞和生化變化情況

2.2.1 血細胞指標

感染CV-B2 后恒河猴嬰猴白細胞數從第1 天開始呈現出下降的趨勢,第3 天回升,之后趨于平穩(見圖3A);單核細胞在第1 天升高,然后下降,第4天開始上升恢復到正常水平(見圖3B);淋巴細胞數在感染后第1 天急劇下降,一直持續到第4 天達到最低點,第5 天開始上升恢復到正常水平(見圖3C);嗜酸性粒細胞總體趨于上升趨勢,在第1 天和第11 天出現急劇升高現象(見圖3D);嗜堿性粒細胞感染后第1 天出現急劇的下降,持續至11 d 逐步回升(見圖3E);中性粒細胞則總體處于上升趨勢(見圖3F)。

2.2.2 生化指標

對恒河猴嬰猴的血清進行生化檢測,發現心肌酶、肝功、腎功都發生了相應的改變,心肌酶乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CKMB)呈現上升趨勢,在第3 天、第5 天和第7 天出現明顯的升高(見圖4A、4B、4C)。 丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、白球比(A/G)、球蛋白(GLB)、總蛋白(TP)和天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)發生不同程度的增高(見圖4D、4E、4F、4G、4H),在第7 天均出現最高峰值。 血清尿素(UREA)在第5 天最高,隨后逐漸下降(見圖4I);血清肌酐(CREA)在感染后第1 天起急劇增高,一直持續到第14 天仍然處于較高水平(見圖4J)。

圖2 恒河猴嬰猴感染CV-B2 的皰疹情況Figure 2 Herpes infection in the rhesus monkeys infected with CV-B2

表2 恒河猴嬰猴感染CV-B2 的臨床癥狀Table 2 Clinical symptoms of the infant rhesus monkeys infected with CV-B2

圖3 恒河猴嬰猴感染CV-B2 后的血細胞的變化情況Figure 3 Changes in blood cells of the infant rhesus monkeys infected with CV-B2

圖4 恒河猴嬰猴感染CV-B2 后的血清生化的變化Figure 4 Changes in serum biochemistry of the infant rhesus monkeys infected with CV-B2

2.3 血液和皰疹PCR 的檢測結果

瓊脂糖凝膠電泳檢測RT-PCR 產物,擴增產物400 bp,擴增條帶見圖5。 經純化測序,單向測序得400 bp 序列,該序列與CV-B2 病毒序列完全一致。

2.4 病理觀察結果

感染后第5 天的皰疹組織通過鏡檢可以看到皰疹呈鱗狀上皮增厚,表面角化過度,局部壞死伴炎細胞浸潤,膿腫形成(見圖6)。

3 討論

圖5 恒河猴嬰猴感染CV-B2 后血液皰疹檢測結果Figure 5 Blood herpes test results after the infant rhesus monkeys infected with CV-B2

圖6 恒河猴嬰猴感染CV-B2 后的皰疹的病理改變(HE 染色)Figure 6 Pathological changes of herpes in the infant rhesus monkeys after CV-B2 infection(HE staining)

手足口病病毒感染動物模型主要包括小鼠、乳鼠、免疫缺陷小鼠、受體基因修飾小鼠、樹鼩和非人靈長類動物等[11],主要研究集中在EV-A71,CVA16,CV-A6 和CVA10 病原體,引起神經損傷、后肢麻痹以及呼吸道受累等癥狀[12-16]。 但是柯薩奇B病毒主要引起心臟、胰腺、肝、腎等組織器官的病變,不同的臨床CV-B 分離株與CAR 均有明顯的相互作用[17-18]。 早有報道顯示,大于90%的CV-B 感染發生在嬰兒、兒童和青少年中,因此,建立敏感的新生兒CV-B 感染的動物模型對于發病機制的研究至關重要[19]。 有研究者利用3～4 周齡的C3H/He J小鼠先后進行了CV-B3 和CV-B5 的感染,發現CVB3 感染可導致小鼠出現胰腺炎和心肌炎,而CV-B5感染只引起胰腺炎[20]。 Zhong 等[21]用CV-B5 感染3～4 周齡BALB/c 小鼠,發現小鼠在感染6 d 后出現了間質性肺炎和心肌炎。 Dong 等[22]發現CV-B4在小鼠模型上可以發生皮質視神經水腫以及心肌炎的癥狀。 最新報道的韓國Hong 等[23]利用CVB2/04/279 建立的小鼠心肌炎和胰腺炎模型,該模型小鼠感染采用人工注射的方法,這種方式與經呼吸道和消化道等自然感染過程具有一定差別,因此對該病毒感染評價方面會存在一些差異。 非人靈長類作為高等級模式動物,能夠感染腸道病毒的EV71 和CA16,至今非人靈長類的CV-B2 模型尚未有報道[24]。

本實驗通過CV-B2 經口腔感染方式感染恒河猴嬰猴,感染后恒河猴出現WBC 降低,中性粒細胞升高,提示為病毒的感染,結合文獻報道中性粒細胞升高可作為診斷重癥手足口病患兒的一個參考指標,中性粒細胞的增高可能與機體特異性免疫(細胞與體液)功能較低、非特異性免疫炎癥反應代償性增強有關。 淋巴細胞的減少可能是因為CV-B2直接或者間接誘導細胞凋亡,并且凋亡對機體免疫反應產生抑制作用。 CV-B2 感染機體后,單核細胞相應的增加來吞噬病毒,緊接著將所攜帶的抗原決定簇轉交給淋巴細胞,誘導淋巴細胞的特異性免疫性反應進而促進免疫應答的發生。 研究結果中的嗜酸性粒細胞的升高提示啟動了病毒感染的炎癥反應,釋放了炎性顆粒中的內容物,引起組織損傷。

通過對手足口病嬰幼兒患者實驗室檢測發現心肌酶譜的活性變化和持續時間與心肌細胞壞死程度呈正相關,手足口病病程中動態監測心肌酶的指標是有價值的[25]。 恒河猴感染CV-B2 后LDH、CK 升高表明不同程度的心肌損害,而CK-MB 是心肌特異性同工酶,在心肌細胞中含量最高,正常血清中含量極微,當心肌細胞受損時釋放入血,故對判斷心肌損害具有高度特異性,因此CKMB 升高提示心肌的受損[26],因此我們預測在恒河猴嬰猴感染的早期就出現了心肌的損傷情況。

20 世紀初,就有相關報道指出CV-B2 與肝衰竭的相關性。 眾所周知,ALT、AST 是人體內廣泛分布的酶,主要存在于肝臟、心臟組織細胞中,當這些組織發生病變時,該酶活力增多,表明在感染CV-B2后肝細胞受損,細胞膜通透性增加,胞漿內的ALT、AST 釋放入血,導致血清濃度可升高。 恒河猴感染第7 天GLB 升高,可能是機體對抗病毒感染持續產生球蛋白發揮免疫作用。 TP 和GLB 水平表現出相同的變化趨勢,這可能是二者與CV-B2 病毒感染后機體代謝增加有關。 多項臨床研究表明使用丙種球蛋白治療手足口病可以改善癥狀,加快恢復[27-28]。 Lin 等[29]人的研究也表明使用高劑量的丙種球蛋白治療重癥手足口病效果很好。 而A/G在第七天同時發生增高,說明發生感染之后出現了肝臟的合成功能的異常。 同時CREA、UREA 的改變,同時使腎臟功能受到損傷并也可能發生了一定的病變。

通過RT-PCR 方法檢測血液和皰疹液中病毒,同時皰疹組織出現鱗狀上皮增厚,局部壞死伴炎細胞浸潤,膿腫形成等病理改變,可以確定引起恒河猴嬰猴出現一系列臨床癥狀的病原體為CV-B2,并出現病毒血癥的發生。

因此經口腔方式(消化道)感染恒河猴嬰猴后出現體溫升高,手、足、口、生殖器等部位出現皰疹,血象、心肌酶、肝功能和腎功能的改變,結合RTPCR 和病理結果可以確定恒河猴嬰猴感染CV-B2后出現了典型的手足口病的癥狀和多器官的損傷。

基于以上研究的成果,我們認為該模型選取的動物年齡適當、感染方式、樣本選取和檢測方法和技術是可行的,其所有結果均反映了一個較為完整的病毒感染的過程,能夠復制和再現相應模型的臨床、病原、病理及實驗室檢測情況,該研究結果為后續利用恒河猴感染建立CV-B2 手足口病模型,開展致病機制、病理學、免疫學以及藥物和疫苗的研發和評價等積累了資料、奠定了良好的基礎。