浙貝黃芩湯調控Wip1 基因表達發(fā)揮抗小鼠白血病作用

徐昊淼,劉朝陽,陳成順,蘇 鑫,許亞梅?

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院,北京 100853; 2.國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫(yī)學研究中心/中國醫(yī)學科學院北京協和醫(yī)學院腫瘤醫(yī)院,北京 100021; 3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京 100700)

白血病的治療手段主要以化療、造血干細胞移植及免疫治療為主。 急性白血病特征為復發(fā)和對治療的抵抗,當用標準化學療法治療時,60%～80%的患者將達到緩解但是大多數患者會復發(fā),一旦復發(fā),該疾病對重復治療更具抵抗力[1]。 反復化療能夠引起機體免疫抑制、增加肝腎損傷,使白血病患者生存質量下降甚至導致死亡。 以長期臨床經驗為依據,課題組所在科室研制了以祛瘀化痰為功的復方浙貝顆粒,配合西醫(yī)臨床手段進行治療。 復方浙貝顆粒可與化療藥物聯合應用以緩解白血病癥狀,減輕放化療毒性,增強化療藥物的敏感性,提高患者免疫功能、抑制細胞惡性增殖,誘導白血病細胞分化凋亡[2];但該方未能有效緩解白血病患者發(fā)熱、口舌生瘡、厭食等癥狀,故而在復方浙貝顆粒基礎上加一味黃芩,組建了浙貝黃芩湯,既能夠改善白血病患者“痰瘀互阻、熱毒夾濕”的臨床證候,又有助于控制感染,縮短抗生素使用時間,發(fā)揮了抗白血病及緩解炎癥反應的作用,改善患者生存質量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級BALB/c nude 小鼠,雌性27 只,5 ～6 周齡,小鼠平均體重為(18±0.79)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006],飼養(yǎng)于中國科學院動物研究所屏障環(huán)境動物房SPF層流柜中[SYXK(京)2013-0015]。 實驗方案符合3R 原則并通過了北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院實驗動物管理和使用委員會(IACUC)審批(2017-39)。

1.1.2 細胞

小鼠白血病細胞M1 購于上海素爾生物科技有限公司,常規(guī)培養(yǎng)并傳代。

1.2 主要試劑與儀器

浙貝黃芩湯水煎劑購買于中國北京同仁堂(集團)有限公司,組成：浙貝母、黃芩、川芎、防己,并由北京同仁堂制備熬成中藥湯劑,每劑熬成中藥湯劑濃煎50 mL,分裝于15 mL 離心管中,于4℃冰箱中保存。

注射用鹽酸多柔比星(海正輝瑞制藥有限公司,H33021980)：用5 mL 無菌水溶解藥末,配制成1 mg/mL 的儲備液,避光保存于-20℃冰箱備用,實驗臨用時,用滅菌注射用水稀釋該儲備液至0.1 mg/mL。

RPMI-1640 培養(yǎng)基(北京利維寧生物科技有限公司);Gibco 胎牛血清(北京裕恒豐科技有限公司);青霉素和鏈霉素各100 U/mL(Sigma);Anti-Mouse CD117-APC、 Anti-Mouse CD33-PE-Cyanine7(ThremoFisher)。 Wip1(D47)Rabbit mAb #11901 一抗(Cell Signaling)PBS;TRIzol(美國Sigma 公司);50 mL 離心管、15 mL 離心管(美國Corning 公司);氯仿、無水乙醇(北京化工廠);PCR 耗材(北京希凱恩生物科技有限公司);DEPC 水(GenStar 公司);AMV Buffer、5×AMV Buffer、dNTP、RNA inhibitor、SYBR Premix Ex Taq(大連寶生物Takara 公司);β-actin、Wip1、P53 實時定量PCR 引物(北京擎科新業(yè)生物技術有限公司);Oligo DT(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)。

臺式冷凍離心機(美國ThermoScientific,型號Sorvall Legend RT);CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus 公司);流式細胞儀(美國Beckman Coulter 公司,型號EpicsXL);反轉錄儀(美國伯樂,C1000);熒光定量PCR 儀(ABI7500 美國伯樂);蛋白質常規(guī)電泳系統(tǒng)電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、垂直電泳槽(美國伯樂Mini-PROTEAN Tetra)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞及動物

白血病細胞M1 接種于含有20%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基的10 cm 細胞培養(yǎng)皿中,37℃、5% CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

小鼠飼養(yǎng)于中國科學院動物研究所屏障環(huán)境動物房SPF 層流柜中,含復合維生素B 的標準顆粒飼料、飲水、墊料及一切與鼠接觸的物品均經滅菌處理。 實驗室內溫度約為25℃,相對濕度為40%～70%,每日光照時間為12 h,實驗前適應性飼養(yǎng)1 周。

1.3.2 造模及分組

1.草魚養(yǎng)殖主要技術關鍵是投餌，也就是要掌握好投餌率，包括不同溶氧、不同天氣、不同水溫、不同生長階段的投餌率。

將對數生長期的小鼠白血病細胞M1 濃度調整為8×106個/只,通過尾靜脈注射法構建小鼠白血病模型[3]。 依據總體設計對該實驗進行分組,造模成功后,將白血病模型動物隨機分成四組,每組6 只,共24 只即：模型組、浙貝黃芩湯灌胃(中藥)組、鹽酸多柔比星腹腔注射(化療)組、浙貝黃芩湯灌胃+鹽酸多柔比星腹腔注射(聯合)組,另將3 只健康小鼠設為空白對照組。

1.3.3 實驗動物給藥方案

經尾靜脈注射細胞10 d 后檢測動物外周血白細胞計數,CD33+CD117+細胞比例以鑒定模型,造模成功后開始給藥。 模型組動物灌胃等劑量蒸餾水;中藥組灌胃浙貝黃芩湯,化療組腹腔注射多柔比星,聯合組灌胃浙貝黃芩湯、腹腔注射多柔比星。

多柔比星藥劑量為1 mg/kg,隔日1 次,共7 次,為使化療藥效充分發(fā)揮,停藥后適應性飼養(yǎng)一周觀察;浙貝黃芩湯的用藥劑量為臨床用藥的7 倍(7.58 g /kg),每日1 次,共21 次。

1.3.4 實驗觀察指標

觀察小鼠的一般情況,檢測血常規(guī)。

于給藥后第30 天或動物瀕死前處死取材,眼球取血收集動物血液檢測Wip1 mRNA,觀察動物肝脾的形態(tài),取脛骨、腓骨骨髓FCM 檢測骨髓中CD33+CD117+比例;取部分肝脾進行Western blot 檢測WIP1 的蛋白表達,余下部分進行組織病理切片HE染色,觀察浸潤灶。

實時定量PCR 檢測引物序列見表1。

表1 實時定量PCR 檢測引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR detection of primer sequences

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 一般情況

圖1 模型組、中藥組、化療組、聯合組的生存狀態(tài)Figure 1 The survival status of the mice in the Model group, CFSD group, Adr group and Adr+CFSD group

2.2 小鼠給藥干預后體重變化

圖2 各組小鼠生存曲線Figure 2 Survival curves of the mice in each group

第20 天時,模型組、中藥組、化療組小鼠體重下降與空白組相比具有明顯差異;第20 天時,除空白組外,各組小鼠體重均有下降,模型組體重最低,聯合組體重價下降趨勢最平緩。 聯合組與空白組比較差異無統(tǒng)計學意義,治療組與模型組比較均無統(tǒng)計學差異。 見表2、圖3。

表2 各組小鼠體重變化(g,±s)Table 2 Changes in body weight of the mice in each group

表2 各組小鼠體重變化(g,±s)Table 2 Changes in body weight of the mice in each group

注：與空白組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note. Compared with the normal group,?P＜0.05, ??P＜0.01.

組別Group n 干預前Before第1 天1st day第5 天5th day第10 天10th day第15 天15th day第20 天20th day空白組Normal 3 18.32±0.24 18.72±0.37 19.69±0.33 19.85±0.02 19.97±0.49 19.79±0.38模型組Model 6 17.83±1.30 18.63±0.65 18.68±0.60 18.51±1.03 17.33±1.07 14.50±1.17??中藥組CFSD 6 17.94±0.70 18.20±0.68 18.76±0.68 18.27±0.83 17.65±1.61 15.66±2.35??化療組Adr 6 18.19±0.54 18.24±0.98 19.20±0.99 18.18±0.89 16.72±1.84 15.11±3.65??聯合組Adr+CFSD 6 17.88±0.76 18.02±1.36 18.46±1.43 17.53±2.14 17.78±1.48 17.08±1.84 F 0.758 3.492 1.066 6.361 6.927 3.268 P 0.564 0.686 0.399 0.140 0.089 0.039

圖3 各組小鼠體重變化曲線Figure 3 Body weight curves of the mice in each group

2.3 小鼠干預前后全血細胞分析變化情況

與空白組相比,各組小鼠外周血白細胞明顯升高,與模型組相比,治療組小鼠外周血白細胞數量下降;與空白組相比,各組小鼠外周血血紅蛋白稍有降低,化療組外周血血紅蛋白含量明顯低于其他組;各組小鼠外周血血小板計數雖有變化,與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見表3。

2.4 外周血涂片白血病細胞比例

除空白組外,各組小鼠外周血涂片中可見白血病細胞,與模型組比較,化療組及聯合組小鼠外周血白血病細胞比例顯著降低,中藥組與模型組、化療組與聯合組比較時差異無統(tǒng)計學意義,見表4。

表3 小鼠全血細胞分析(±s)Table 3 Changes in whole blood cell analysis of the mice

表3 小鼠全血細胞分析(±s)Table 3 Changes in whole blood cell analysis of the mice

注：與模型組比較,?P＜0.05,??P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the normal group,?P＜0.05, ??P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups n 白細胞計數(×109/L)WBC counts(×109/L)血紅蛋白含量(g/L)Hemoglobin content(g/L)血小板計數(×109/L)Platelet count(×109/L)空白組Normal 3 2.81±0.31 158.67±9.29 760.67±64.83模型組Model 6 9.33±2.20? 156.67±10.01 833.33±135.71中藥組CFSD 6 6.55±2.26?# 155.01±21.80 689.50±152.31化療組Adr 6 4.09±2.70??## 121.67±23.05## 874.33±399.36聯合組Adr+CFSD 6 6.67±2.04 141.20±8.04 1054.60±260.065 F 5.897 4.673 1.602 P 0.003 0.007 0.211

表4 小鼠外周血白血病細胞比例(±s,n=6,%)Table 4 Changes in the proportion of leukemia cells in peripheral blood of the mice

注：與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups白血病細胞Leukemia cells模型組Model 12.60±9.71中藥組CFSD 7.00±3.61化療組Adr 1.58±1.75##聯合組Adr+CFSD 2.75±1.67#F 8.574 P 0.036

2.5 CD33+CD117+細胞比例

與空白組相比,各組小鼠骨髓中C D33+CD117+表達量顯著增高;與模型組相比,治療組小鼠骨髓中CD33+CD117+表達量下降,模型組＞中藥組＞化療組＞聯合組,中藥組與化療組、中藥組與聯合組、化療組與聯合組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

與模型中相比,各組小鼠外周血細胞中CD33+CD117+比例下降,模型組＞中藥組＞化療組＞聯合組,中藥組與化療組、中藥組與聯合組比較,差異無統(tǒng)計學意義,見表5、圖4。

2.6 小鼠脾稱重

與空白組相比,各組小鼠都有不同程度的脾大,中藥組小鼠脾重量最輕,聯合組次于中藥組,與化療組脾重量相當,模型組＞化療組＞聯合組＞中藥組,中藥組與化療組、中藥組與聯合組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01),見表6、圖5。

表5 小鼠骨髓及外周血中CD33+CD117+表達(±s,%)Table 5 Changes of CD33+CD117+ expression in bone marrow and peripheral blood of the mice

表5 小鼠骨髓及外周血中CD33+CD117+表達(±s,%)Table 5 Changes of CD33+CD117+ expression in bone marrow and peripheral blood of the mice

注：與空白組比較,?P＜0.05,??P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the normal group, ?P＜0.05, ??P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups n 骨髓Bone marrow外周血Peripheral blood空白組Normal 3 0.75±0.29 -模型組Model 6 47.75±11.76 18.89±2.52中藥組CFSD 6 40.14±11.62## 10.52±2.28##化療組Adr 6 26.43±4.09## 3.85±0.24##聯合組Adr+CFSD 6 15.36±5.58## 2.13±0.61##F 23.495 48.616 P 0.000 0.000

圖4 小鼠骨髓及血液中CD33 陽性細胞Figure 4 CD33 positive cells in the blood of mice

小鼠肝稱重可見各組重量相當,各組比較無統(tǒng)計學差異。

2.7 小鼠肝脾形態(tài)變化

各組小鼠脾都有不同程度的腫大,除中藥組外,其余各組脾均可見壞死灶;鏡下視野可見小鼠脾中存在多核仁、瘤聚細胞形成的浸潤灶組織,體積大,核大而圓,脾結構被白血病細胞破壞。 模型組小鼠的脾中有大量彌漫性白血病細胞浸潤灶,數量上明顯多于其他三組,一個400 倍視野最多可觀察到5～6 個白血病細胞。 中藥組及聯合組小鼠脾病理切片中,能夠觀測到的白血病細胞浸潤灶較少,脾內結構基本完整,但依然可見有白血病細胞的浸潤。

鏡下可見各組小鼠的肝組織結構被破壞,部分白血病細胞浸潤,各組小鼠肝表面可見白色浸潤灶,模型組小鼠浸潤灶數量較多,單純中藥組及聯合組小鼠肝較少,化療藥小鼠肝表面粗糙,考慮可能是由于化療藥物所致,聯合組小鼠未見嚴重的肝損傷,考慮可能與中藥的作用有關。 見圖6、圖7。

2.8 小鼠Wip1 mRNA 的表達水平

模型組較空白組骨髓Wip1 mRNA 顯著增加,治療組Wip1 mRNA 表達量較模型組顯著降低,聯合組的小鼠骨髓Wip1 mRNA 的表達最低,模型組＞化療組＞中藥組＞聯合組,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。各組外周血中Wip1 mRNA 表達差異較小無統(tǒng)計學意義,見表7、圖8。

表6 小鼠肝脾的重量(±s,g)Table 6 Weight of liver and spleen of the mice

表6 小鼠肝脾的重量(±s,g)Table 6 Weight of liver and spleen of the mice

注：與空白組比較,?P＜0.05,??P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the normal group, ?P＜0.05, ??P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups n 肝Liver脾Spleen空白組Normal 3 1.066190±0.034459 0.156837±0.009639模型組Model 6 1.167540±0.153007 0.255680±0.030474??中藥組CFSD 6 0.992438±0.041468 0.182473±0.007355##化療組Adr 6 1.059987±0.403035 0.218290±0.013861?#聯合組Adr+ CFSD 6 1.096196±0.192931 0.213370±0.008098?##F 0.553 15.035 P 0.700 0.002

圖5 各組小鼠脾稱重Figure 5 Comparison of the mouse spleen weight in each group

2.9 Western blot 結果

反復實驗加大檢測蛋白劑量后,各組肝脾中WIP1 蛋白表達量仍無明顯變化,中藥組、化療組、聯合組與模型組相比差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),WIP1 在白血病小鼠肝脾中的表達仍需進一步研究,見表8、圖8。

圖7 各組小鼠脾的病理變化(HE 染色)Figure 7 Pathological changes of the mouse spleen in each group(HE staining)

表7 各組小鼠骨髓及血液中Wip1 mRNA 的相對表達量Table 7 Relative expression levels of Wip1 mRNA in bone marrow and blood of the mice in each group

表8 肝脾中WIP1 蛋白表達量Table 8 WIP1 protein expression in the mouse spleens and livers

圖8 小鼠肝脾中WIP1 蛋白量表達Figure 8 Expression of WIP1 protein in the mouse livers and spleens

3 討論

Wip1 由野生型P53 誘導[4-5],屬于2C 型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP2C 家族中的一員,是DNA損傷反應和腫瘤發(fā)生的重要調節(jié)因子,能夠參與造血功能調節(jié)。 Wip1 由催化結構域N 端和非結構化C 端組成[6],與PP2C 家族的其他成員不同的是,其靠近活性位點的催化結構域中存在獨特的皮瓣亞結構域,使得Wip1 能夠選擇性作用于其它磷酸酶[7-8]。 Wip1 既能夠直接作用于P53 的去磷酸化過程,使Ser15 位點失活,也能夠作用于p38 蛋白(Thr180) 蛋白激酶來抑制P38 通路下游的分子P53的活性[9-11]。 Wip1 基因的缺失或者失活能夠抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,多種實體瘤的發(fā)病都與Wip1 的過表達有關[12-13],在血液腫瘤中也存在Wip1 的過表達[14-15]。

中藥能夠緩解癌癥癥狀,減輕放化療毒性,提高患者生存質量,延長生存期,在多種惡性病的治療中均有應用[16-22]。 本次實驗應用急性髓系白血病動物模型,探索浙貝黃芩湯能否通過下調Wip1 的表達發(fā)揮抗白血病作用。 方中浙貝味苦性寒,歸肺、心經,功效化痰止咳,清熱散結;黃芩,其味苦、性寒,歸肺、心、肝、膽、大腸經,具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效;防己味苦、辛,性寒;歸膀胱、肺經,可祛風勝濕;川芎,辛,溫,歸肝、膽、心包經,可活血行氣,祛風止痛。 四藥相和發(fā)揮抗白血病作用,既能與白血病細胞抗衡,又有效的保護小鼠臟器的完整性;浙貝黃芩湯與化療藥各有優(yōu)勢又相輔相成,能夠有效減輕化療的副作用,一定程度上能夠提高小鼠生存質量,且中藥、化療藥均能夠通過Wip1 通路發(fā)揮作用,下調Wip1 mRNA 的相對表達量。 由于白血病發(fā)展后期實驗組小鼠狀況較差無法收集足夠的骨髓樣本分選細胞進行Western blot實驗,故實驗改用肝脾組織進行檢測,小鼠的肝脾組織中雖有大量白血病細胞浸潤,但多次實驗仍未檢測出WIP1 蛋白條帶,分析可能是由于Wip1 從基因到蛋白層面間存在復雜的轉錄翻譯過程[23-24],使基因表達與蛋白表達之間存在差異,因此我們仍需進一步研究,為日后明確中藥復方浙貝黃芩湯如何發(fā)揮作用提供研究基礎。

本實驗證實了浙貝黃芩湯能夠降低Wip1 在白血病基因中的表達,一定程度上能夠緩解白血病癥狀、保護臟器完整性、提高化療有效率,但單純應用浙貝黃芩湯對抗白血病效力較弱,需與化療藥結合才能更好的發(fā)揮抗白血病的作用。