培養條件對食源性混合病原菌生物被膜形成的影響

張鈺皎，胡煒東，黃海英，趙雪平，孫子羽，滿都拉，陳忠軍，*

（1.內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特010018；2.內蒙古農業大學職業技術學院，內蒙古包頭014109）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌（Salmonella）是重要的食源性病原菌，其引起的食物中毒是最常見的細菌性疾病之一[1]。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌適應性極強，在各種不利環境中通常以生物被膜的形式生存[2]。細菌生物被膜（biofilm）是嵌入胞外多糖中的有組織的微生物聚集體，微生物附著于物體表面后，通過相互作用釋放胞外多糖將自身包裹其中而形成生物被膜[3]。食源性病原菌在形成生物被膜后對外界不良環境抵抗力增強，極難被抗生素等殺菌劑清除[4]。食源性病原菌生物被膜會對食品加工器具設備、加工廠地板和墻壁表面造成持續性污染，一旦清除不完全將會導致嚴重的食品安全問題，并造成因食品腐敗而引起的經濟損失[5]。

生物被膜的形成過程中受到多種營養因素的調控，比如載體、生長溫度、時間、pH 值、培養基質量分數、碳源、氮源和活菌數等極大影響著生物被膜的形成量和黏附率[6]。鄧開野等[5]發現金黃色葡萄球菌（S.aureus）生物被膜受到溫度、pH 值、初始菌濃度的影響。Rode等[8]發現溫度、氯化鈉、葡萄糖和乙醇的聯合作用可促進金黃色葡萄球菌生物被膜的形成。食品加工環境的不同，形成食源性病原菌生物被膜的結構也會不同。目前，國內外學者主要致力于研究單一菌種生物被膜的形成條件，對混合菌生物被膜研究鮮少。因此，探究培養條件對混合菌生物被膜形成的影響至關重要。

本文以96 孔聚苯乙烯培養板為載體，經結晶紫染色法染色后，通過測定其黏附率，探究培養基pH 值、培養溫度和培養時間對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌形成的混合菌生物被膜的影響，并采用響應面法優化最佳培養條件。根據文獻資料獲得3株單一菌的最佳培養條件[9-11]，在最佳形成條件下探究胰蛋白胨大豆肉湯（tryptone soy broth，TSB）培養基質量分數、NaCl 質量分數和葡萄糖質量分數對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌及其混合菌形成的生物被膜的影響。揭示培養條件對單一菌和混合菌生物被膜的影響規律，為今后探究食源性病原菌生物被膜生理生化特性和控制食品加工環境中生物被膜的形成提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）CMCC 26003-3、大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 11775-3、沙門氏菌（Salmonella）ATCC 14028：中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 試劑

磷酸氫二鉀、磷酸氫二鈉：天津市永大化學試劑開發中心；結晶紫、氯化鈉、氯化鉀：鴻之惠商貿有限公司；草酸銨、甲醇、冰醋酸、乙醇：上海國藥集團化學試劑有限公司。以上所用試劑均為分析純。

1.1.3 培養基

胰蛋白胨大豆肉湯培養基：北京陸橋生物技術有限公司。

1.2 主要儀器與設備

Synergy H1 全功能微孔板檢測儀：美國伯騰儀器有限公司；SW-CJ-1FD 超凈工作臺：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；GHP 隔水式恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；LDZX 全自動高壓滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；浦春JY 系列電子天平：上海浦春計量儀器有限公司；XH-C 漩渦混勻器：常州未來儀器制造有限公司；PHS-3 型pH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌懸液的制備

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌活化后，分別接種于 TSB 培養基，于 37 ℃、120 r/min 恒溫培養箱中培養過夜。將菌懸液稀釋至OD600nm約為0.1，備用[12]。

1.3.2 單一菌和混合菌生物被膜的培養

將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌以1%的接種量分別接種于事先裝有200 μL TSB 培養基的96 孔微量板中，37 ℃下培養24 h 后，微孔板檢測儀測其630 nm 下的光密度值A1，空白對照記為A1C。空白對照組只加TSB 培養基，且試驗組及對照組均進行3 次平行試驗。將3 株單一菌懸液以體積比1 ∶1 ∶1 混合后，以1%的接種量接種于每孔添加了200 μL TSB 培養基的標準96 孔板中。在最適條件下培養后，用微孔板檢測儀測定630 nm 下的光密度值，處理方法同單一菌[13]。

1.3.3 生物被膜黏附率的測定

棄去96 孔板中的培養基后，每空加入300 μL 磷酸鹽緩沖液沖洗3 次；然后于每孔中添加200 μL 無水甲醇固定15 min 后棄去懸浮液，并于60 ℃下干燥1 h；隨后添加200 μL 2 %結晶紫染液染色20 min，蒸餾水沖洗孔壁至沖洗液無色，干燥；最后于每孔中添加300 μL 33%冰醋酸，放置10 min；微孔板檢測儀震蕩 10 min 后測定 A2和 A2c[14]。黏附率（B 值）的計算公式為：

式中：A1、A2為培養和染色后的光密度值；A1c、A2c為空白對照的光密度值。

1.3.4 混合菌生物被膜最佳形成條件的確定

1.3.4.1 培養基pH 值、培養溫度和培養時間對混合菌生物被膜黏附率的影響

分別配制 pH 值為 5、6、7、8、9 的 TSB 培養基，滅菌[15]。每孔中分別加入200 μL 上述培養基，混合菌接種后于37 ℃下靜置培養24 h。混合菌黏附率的檢測如上所述，平行試驗3 次。以混合菌生物被膜的黏附率確定最佳培養基pH 值。用此方法依次確定混合菌生物被膜的最佳培養溫度（25、30、37、40、45 ℃）和培養時間（12、24、36、48、60 h）[16]。

1.3.4.2 通過響應面分析確定混合菌生物被膜最佳培養條件

依據單因素試驗結果，對培養基pH 值、培養溫度和培養時間3 個影響因素進行響應面分析。使用Design Expert 8.0.6 軟件設計模型，獲取最佳培養條件參數。

1.3.5 不同營養條件對生物被膜黏附率的影響

1.3.5.1 培養基質量分數對生物被膜黏附率的影響

分別配制質量分數為0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、6.4%的TSB 培養基，滅菌。每孔中分別加入200 μL 不同質量分數的TSB 培養基，單一菌和混合菌分別在最適條件下培養[17]。參照1.3.3 測定單一菌和混合菌生物被膜的黏附率，進行3 次平行試驗。

1.3.5.2 NaCl 質量分數對生物被膜黏附率的影響

分別配制含NaCl 質量分數為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的 TSB 培養基，滅菌后于每孔中加入200 μL 含不同NaCl 質量分數的TSB培養基，單一菌和混合菌生物被膜的培養方法及黏附率的檢測方法如1.3.2 和1.3.3 所述，平行試驗3 次[18]。

1.3.5.3 葡萄糖質量分數對混合菌生物被膜黏附率的影響

分別配制含葡萄糖質量分數為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的 TSB 培養基，滅菌后于每孔中加入200 μL 含不同葡萄糖質量分數的TSB 培養基，單一菌和混合菌生物被膜的培養方法及黏附率的檢測方法同1.3.2 和1.3.3，平行試驗3 次[19]。

1.3.6 數據統計分析

利用Microsoft Excel 2016 進行統計作圖處理，Design Expert 8.0.6 軟件設計響應面模型。

2 結果與分析

2.1 混合菌生物被膜最佳形成條件的確定

2.1.1 不同培養基pH 值、培養溫度和培養時間對混合菌生物被膜黏附率的影響

將不同條件下形成的混合菌生物被膜結晶紫染色法染色后，對混合菌生物被膜黏附率（B 值）進行測定，確定最佳培養基pH 值、培養溫度和培養時間，結果如圖1 所示。

圖1 培養基pH 值、溫度和時間對混合菌生物被膜黏附率的影響Fig.1 Effect of medium pH value，temperature，time on the adhesion rate of mixed biofilm

由圖1 可知，混合菌生物被膜的黏附率隨著培養基pH 值的變化呈現先提高后降低的趨勢，并于pH 7時達到最大黏附率0.036 4。馬燕等[20]研究蜂房哈夫尼亞菌生物被膜時發現，中性培養條件更利于其生物被膜的形成。因此，在混合菌生物被膜培養中應選用此培養基pH 值，過酸或過堿的培養基都會抑制混合菌生物被膜的形成。混合菌生物被膜的黏附率隨著培養溫度的增加也呈現先提高后降低的趨勢，在37 ℃時的混合菌黏附率高達0.035 1。低于37 ℃時，由于溫度過低，生物被膜形成緩慢，導致黏附能力較弱。而超過37 ℃后，黏附率明顯下降，說明過高的溫度會減弱生物被膜的形成能力。郝旭昇等[21]探究了不同生長溫度（12、25、37 ℃）對阪崎克羅諾腸桿菌ATCC 29004 生物被膜形成的影響，發現25 ℃和37 ℃下阪崎克羅諾腸桿菌的黏附菌量和生物被膜形成量高于12 ℃，但是阪崎克羅諾腸桿菌在37 ℃形成了更加致密且立體的生物被膜結構。綜合考慮，混合菌生物被膜的最佳培養溫度為37 ℃。不同培養時間對B 值的影響顯著，培養24 h時所得的混合菌黏附率明顯高于其他組分，因此選用24 h 為最佳培養時間。

2.1.2 響應面法優化混合菌生物被膜的形成條件

依據單因素試驗分析結果，以黏附率（Y）為響應值，采用Design Expert 8.0.6 設計三因素三水平的Box-Behnken 試驗。響應面模型因素與水平設計見表1。Box-Behnken 試驗設計與結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and their levels of response surface design

表2 Box-Behnken 試驗設計與結果Table 2 Response surface design arrangement and corresponding experimental data

應用回歸分析對方程和方程的各因子進行方差分析，分析結果如表3 所示。

從表3 中可以看出，該模型極其顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），模型的決定系數 R2=0.985 3，因此可選用該方程代替真實試驗點對響應值有效預測和分析。培養時間和培養溫度對混合菌生物被膜的形成影響極顯著（P＜0.01），二次項 A2、B2和 C2極顯著（P＜0.01），交叉項 AB、BC 極顯著（P＜0.01），其它均不顯著。各因素對混合菌生物被膜黏附率的影響程度順序為A>B>C，即培養溫度＞培養時間＞培養基pH 值。

將某因素固定在中心值不變，分析另外兩個因素的交互作用對混合菌生物被膜黏附率的影響結果，如圖2 所示。

圖2 兩因素及其交互作用響應面圖Fig.2 Surface plot and contour for reciprocal effection of three operating parameters

比較圖2 曲面圖和等高線可以看出，培養溫度和培養時間對混合菌生物被膜的黏附率影響顯著，表現為曲面較陡。而培養基pH 值對于黏附率影響不顯著，培養溫度和培養時間的交互作用極顯著。各因素之間兩兩交互作用對混合菌生物被膜黏附率的影響強度由強到弱依次為：AB＞BC＞AC，與方差分析結果一致。回歸方程求解的最佳培養條件經驗證為：培養溫度36.2 ℃，培養時間21.3 h，培養基pH 7.12，此條件下混合菌生物被膜的黏附率可達0.032 4。為實際操作方便，將理論混合菌生物被膜形成條件調整為培養溫度為36 ℃，培養時間為22 h，培養基pH 值為7。

2.2 不同營養條件對生物被膜黏附率的影響

2.2.1 培養基質量分數對生物被膜黏附率的影響

培養基質量分數對生物被膜黏附率的影響見圖3。

圖3 培養基質量分數對生物被膜黏附率的影響Fig.3 Effect of medium quality score on the adhesion rate of biofilm

微生物生物被膜的形成過程中，營養條件是影響其黏附率的最大因素之一。TSB 培養基質量分數的不同，使其為微生物的黏附提供的營養不同，造成微生物生物被膜黏附率的波動。由圖3 可知，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和混合菌生物被膜的黏附率隨著培養基質量分數的變化呈現先增加后減少的趨勢。且當TSB 培養基質量分數為1.6%時，形成的生物被膜黏附率最大，即大腸桿菌黏附率為0.065 2，沙門氏菌為0.030 2，金黃色葡萄球菌為0.083 2 和混合菌為0.035。單一菌和混合菌的黏附率在TSB 培養基質量分數為3.2%時呈明顯下降趨勢，因為微生物在營養脅迫環境下傾向于形成生物被膜，以保護自身不被外界不利條件所影響。研究發現混合菌生物被膜的黏附率低于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌單獨形成生物被膜的黏附率。這表明混合菌生物被膜中的菌株間互相存在著競爭作用，這種競爭作用的存在會使得自然條件下形成的混合菌生物被膜的黏附率有所降低。

2.2.2 NaCl 質量分數對生物被膜黏附率的影響

NaCl 質量分數對3 株單一菌及其混合菌生物被膜黏附率的影響見圖4。

圖4 NaCl 質量分數對生物被膜黏附率的影響Fig.4 Effect of NaCl quality score on the adhesion rate ofbiofilm

從圖4 可以看出，單一菌和混合菌生物被膜的黏附率隨著NaCl 質量分數的增加逐漸降低。剛添加0.2%的NaCl 時，4 種生物被膜的形成都已受到抑制。當NaCl 質量分數為0.4%時，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌單獨形成的生物被膜明顯被抑制，即下降率為大腸桿菌0.026，金黃色葡萄球菌0.042，沙門氏菌0.012。但混合菌生物被膜的總體下降率明顯低于3 株單一菌的下降率，說明混合菌生物被膜對NaCl 的敏感性較弱。根據文獻[22]可知，混合菌生物被膜中菌株的相互競爭作用雖導致黏附率降低，但是由于不同微生物分泌的胞外物質不同，增加了混合菌生物被膜的復雜性使得混合菌生物被膜對外界的抵抗力較強。高濃度的NaCl 產生的滲透壓可使細胞脫水直至死亡[23]。因此，NaCl 質量分數越高，微生物生物被膜的黏附率越低。可推測一定濃度的NaCl 可以有效抑制微生物形成生物被膜，為食品加工中有效控制生物被膜的生長提供依據。

2.2.3 葡萄糖質量分數對生物被膜黏附率的影響

葡萄糖質量分數對生物被膜黏附率的影響見圖5。

圖5 葡萄糖質量分數對生物被膜黏附率的影響Fig.5 Effect of glucose quality score on the adhesion rate of biofilm

微生物生物被膜中的主要成分是多糖，糖源是調控微生物形成生物被膜的主要因素之一。靳嘉巍等[24]研究表明，碳源直接決定了微生物形成生物被膜的能力，且含糖量高的微生物形成生物被膜的能力愈高。由圖5 可知，單一菌和混合菌在含葡萄糖質量分數為0%～0.8%的TSB 培養基中的黏附率是逐漸上升的，說明葡萄糖可增強單一菌和混合菌生物被膜的形成能力。且大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和混合菌的黏附率于葡萄糖質量分數為0.8%時達到最大，即大腸桿菌黏附率為0.079，沙門氏菌為0.029 8，金黃色葡萄球菌為0.096 6 和混合菌為0.042 2。葡萄糖質量分數1.0%～1.4%間黏附率雖有所下降，但仍可促進細菌黏附作用。因此可知，一定濃度的碳源可有效促進微生物形成生物被膜，且混合菌生物被膜對葡萄糖較單一菌生物被膜敏感性強，在葡萄糖僅為0.2%時黏附率已高達0.038 2，且基本維持穩定。因此在食品加工過程中，應多次清洗食品加工器具及設備，盡可能降低食品加工過程中的糖分殘留量，以避免微生物形成生物被膜而造成食品安全隱患。

3 結論

以96 孔微量板作為單一菌和混合菌生物被膜的黏附載體，通過單因素試驗和響應面法優化了培養溫度、培養時間和培養基pH 值對食源性病原菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌形成的混合菌生物被膜的最佳形成條件。結果表明，混合菌生物被膜的最佳培養溫度為36 ℃，最佳培養時間為22 h，最適培養基pH 值為7。在此最佳培養條件下進一步研究營養物質對單一菌和混合菌生物被膜形成能力的影響，研究發現TSB 培養基質量分數、NaCl 質量分數和葡萄糖質量分數均對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌和混合菌生物被膜的形成能力有顯著影響。其中TSB 培養基質量分數為1.6 %時形成的生物被膜黏附率最大；碳源加強了單一菌和混合菌生物被膜的黏附率，因此在高糖類食品生產中應格外注意病原菌生物被膜的形成；而當NaCl 質量分數大于0.4%時，對食源性病原菌生物被膜的形成有一定的抑制作用，因此在食品加工中可以通過添加NaCl，并結合其它抑菌方法來抑制清除食源性病原菌形成的生物被膜。