無溶劑體系微波輔助脂肪酶催化合成玉米淀粉酯

馬惠琳，辛嘉英，2，*，鄭麗娜，王艷，崔添玉

（1.哈爾濱商業大學食品工程學院，黑龍江哈爾濱150010；2.中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅蘭州730000）

天然淀粉來源廣泛，因其具有無毒性、可再生、可生物降解和可改性的特性廣泛應用于食品工業、藥用輔料和添加劑、紡織品、紙張和包裝材料等領域[1-3]。但由于天然淀粉親水性強、脆性高、加工性差、在普通有機溶劑中不易溶解，這在一定程度上限制了它的進一步應用。故天然淀粉的改性研究非常有意義。與傳統淀粉相比，改性淀粉的性質可以發生顯著改變，從而增加其功能[4-8]。

酯化是對淀粉進行改性的常用手段之一[9-11]。其主要目的是將這種具有結晶性和脆性的材料改性為新的聚合物材料，使這種新材料不溶于水并且具有更高的拉伸強度和增強功能。化學法合成淀粉酯已經被廣泛報道[12-15]。淀粉酯也可以通過酶法合成。酶法合成具有多優點，包括立體選擇性、區域選擇性和化學選擇性。這種高選擇性可以給化學合成提供一些便利，例如減少或消除保護基團、減少副反應、更容易分離和減少環境問題。其他優點如在商業應用中的高催化效率也非常有吸引力[16]。

課題組前期使用脂肪酸作為底物進行淀粉酯[17-20]時底物脂肪酸必須首先通過甘油三酯酯水解步驟獲得后才能進行淀粉酯合成。本研究直接選用脂肪酸甘油酯作為酰基供體可以省去水解反應步驟，通過預處理后的玉米淀粉和篩選出的酰基供體為底物，在無溶劑系統中利用微波輔助脂肪酶催化底物直接進行酯交換反應，一步合成了脂肪酸淀粉酯，從而創造一種制備酯化改性淀粉的新方法，用于生產純天然綠色的脂肪酸淀粉酯。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米淀粉、糖化酶（100 000 U/g）、α-淀粉酶（3 700 U/g）：蘇州暢通化學有限公司；固定化南極假絲酵母脂肪酶（Novozym 435，10 000 U/g）：丹麥Novozymes A/S 公司；豬胰脂肪酶（porcine pancreas lipase，PPL，90 U/g）、固定化嗜熱真菌脂肪酶 （lipozyme TLIM，TLIM，100 U/g）：美國 Sigma 公司；三油酸甘油酯：國藥集團化學試劑有限公司；三軟脂酸甘油酯：成都艾科達化學試劑有限公司；三硬脂酸甘油酯、3? 分子篩：天津光復精細化工研究所；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

超聲波細胞破碎儀（SCIENTZ-ⅡD）：寧波新芝生物科技股份有限公司；EMS-8C 型恒溫磁力攪拌器：天津歐諾儀器儀表有限公司；JJ-1 型精密定式電動攪拌器：江蘇榮華儀器制造有限公司；XH-100 型微波催化合成/萃取儀：北京祥鵠科技發展有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 淀粉預處理方法篩選

將玉米淀粉使用不同方法進行預處理操作，再用處理后的淀粉制備脂肪酸淀粉酯，以產物取代度為指標篩選出最優預處理方法，后續試驗操作使用的淀粉均先用最優方法處理。

1.3.1 酶解法（enzymatic method，ES）

稱取15 g 玉米淀粉與100 mL、pH 4.6 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液混勻，45 ℃水浴預熱后向淀粉懸浮液中加入適量用緩沖溶液配制的淀粉酶液（糖化酶∶α-淀粉酶=3 ∶1，質量比），42 ℃攪拌反應 24 h 后，用4%的氫氧化鈉5 mL 停止反應。淀粉懸浮液5 000 r/min離心5 min，去離子水洗滌剩余淀粉后離心，此過程循環多次后將得到的淀粉于50 ℃下烘干至恒重，研磨過篩后得到預處理淀粉[21]。

1.3.2 化學法（chemical method，CS）

將 NaOH、尿素按 2 ∶1（質量比）用 100 mL 蒸餾水中配成混合水溶液，先預冷至一定溫度，向其中緩慢加入5 g 玉米淀粉快速攪拌制得均勻的淀粉糊。滴加稀鹽酸至淀粉糊呈中性，再緩慢滴加無水乙醇使淀粉沉淀析出。將淀粉懸浮液用95%乙醇溶液抽真空洗滌數次，再用無水乙醇洗滌后烘干至恒重，研磨過篩后得到預處理淀粉[22]。

1.3.3 預糊化法（pregelatinization method，GS）

配制質量分數為5%的淀粉糊置于60 ℃的恒溫水浴中糊化30 min，糊化后于50 ℃真空干燥得到預處理淀粉。

1.3.4 超聲法（ultrasonic method，US）

10 g 玉米淀粉和40 mL 無水乙醇常溫攪拌均勻，在超聲功率50 W 下處理30 min，用80%乙醇溶液洗滌淀粉后抽濾后烘干至恒重，研磨過篩后得到預處理淀粉。

1.4 脂肪酶種類的篩選

酰基供體選用三油酸甘油酯（triolein，GTO），以產物取代度為指標研究在淀粉2 g，GTO 15 g，脂肪酶4%，微波功率700 W，溫度60 ℃，200 r/min 攪拌，反應時間2 h 條件下，固定化南極假絲酵母脂肪酶（N435）、豬胰脂肪酶（PPL）、固定化嗜熱真菌脂肪酶（TLIM）3 種脂肪酶對脂肪酸酯合成的影響。篩選最適脂肪酶用于后續試驗。

1.5 酰基供體的篩選

以產物取代度為指標研究在淀粉2 g，酰基供體15 g，脂肪酶 4%，微波功率 700 W，溫度 60 ℃，200 r/min攪拌，反應時間2 h 條件下，三軟脂酸甘油酯（tripalmitin，GTP）、三硬脂酸甘油酯（tristearin，GTS）、GTO對脂肪酸酯合成的影響。篩選最適酰基供體用于后續試驗。

1.6 微波輔助酶促脂肪酸淀粉酯的合成

在無溶劑的反應體系中，將預處理后的淀粉2 g與三脂肪酸甘油酯15 g 混合均勻，加入一定量N435 脂肪酶，2 g 分子篩，微波功率700 W，攪拌速度200 r/min，在一定溫度條件下反應一段時間。

停止反應時向反應體系中加入25 mL 無水乙醇，充分攪拌后靜止10 min，50 mL 的65 ℃熱無水乙醇洗滌抽濾，重復3 次，產物過80 目篩除去脂肪酶。50 ℃干燥備用。

1.7 脂肪酶活力測定

采用橄欖油乳化法測定并計算脂肪酶活力[23]。

式中：V 為樣品所消耗堿得體積，mL；V0為空白樣品所消耗堿的體積，mL；t 為反應時間，min；n 為稀釋倍數。

1.8 脂肪酸淀粉酯取代度的測定

取代度參考文獻采用氣相色譜法測量[22]。取代度測定所使用的氣相色譜條件如下：色譜柱：DM-FFAP石英毛細管柱，30 mm×0.32 mm×0.25 μm；柱溫：220 ℃，進樣口溫度：250 ℃，檢測器溫度：260 ℃。載氣：高純氮；柱流速：2.0 mL/min；尾吹流速：40 mL/min；氫氣流速：35 mL/min；空氣流速：350 mL/min；分流比 50 ∶1；進樣量1 μL。計算取代度。

取代度=（n×M1）/（M0-n×M2+n×MH2O）

式中：n 為產物脂肪酸淀粉酯中脂肪酸的物質的量，mol；M0為樣品質量，g；M1為葡萄糖殘基的分子量；M2為脂肪酸的分子量；MH2O為水的分子量。

1.9 淀粉酯合成的單因素試驗

對脂肪酸淀粉酯的合成進行工藝優化，選擇反應時間、反應溫度、酰基供體添加量和酶添加量4 個因素進行單因素試驗。優化條件分別為：淀粉添加量2 g，N435 脂肪酶添加量4%，GTO 添加量15 g，分子篩2 g，微波功率700 W，200 r/min 攪拌，反應時間2 h 條件下研究溫度在 55、60、65、70、75 ℃時對產物取代度的影響；不改變其他條件，在最適溫度下研究研究反應時間分別為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h 時對產物取代度的影響；不改變其他條件，在最適溫度和最適時間條件下研究 GTO 添加量分別為 5、10、15、20、25 g 時對產物取代度的影響；不改變其他條件，在最適溫度、時間和GTO 添加量條件下研究酶添加量分別為3 %、4 %、5 %、6%、7%時對產物取代度的影響。

1.10 淀粉酯合成的條件優化

在單因素試驗的基礎上，選擇反應時間、反應溫度、GTO 添加量、酶添加量4 個因素，每個因素根據結果選取較優的3 個水平，安排L9（34）正交試驗見表1，以脂肪酸淀粉酯的取代度作為指標。

表1 正交試驗設計因素與水平Table 1 Factor and level of independent variables used for orthogonal test

2 結果與分析

2.1 淀粉預處理方法篩選

淀粉預處理方法對產物取代度的影響見圖1。

圖1 淀粉預處理方法對產物取代度的影響Fig.1 Effect of pretreatment method of starch on the substitution degree of product

如圖1 所示，與不處理淀粉（NS）直接參與反應相比，各種預處理方法均可以使淀粉的取代度有不同程度的升高，其中超聲波法預處理（US）淀粉取代度最大。這是由于預處理后淀粉顆粒結構被破壞后比表面積增大，酶催化作用所需的接觸面積也相應擴大。由于超聲波法預處理底物取代度最高，因此淀粉的預處理方法選擇超聲法。

2.2 脂肪酶篩選

不同種類的脂肪酶參與酯化反應中酶活力及對脂肪酸淀粉酯的影響見圖2。

由圖2（a）可知N435 脂肪酶的酶活最高，但脂肪酶的活力只能證明發生了反應而不能確定產物的量。所以進一步比較了不同種類的脂肪酶對產物取代度的影響。結果如圖2（b）所示，N435 脂肪酶催化酯化反應的產物取代度遠高于另外兩種脂肪酶，因此后續試驗選用N435 脂肪酶作為催化劑。

2.3 酰基供體對產物取代度的影響

不同酰基供體對脂肪酸淀粉酯的影響見圖3。

圖2 脂肪酶種類對產物取代度的影響Fig.2 Effect of the varieties of lipases on the substitution degree of product

圖3 酰基供體種類對產物取代度的影響Fig.3 Effect of the varieties of acyl donor on the substitution degree of product

由圖3 可知，其中三油酸甘油酯能取得更高的取代度，三硬脂酸甘油酯取代度則最小。這是因為三油酸甘油酯中碳碳雙鍵的存在使分子內羧酸脂肪鏈之間不能緊密接觸，導致油脂分子之間不能緊密接觸，分子間作用力減少，熔點降低，且三油酸甘油酯黏度更小，轉酯反應更快。通過酰基供體的選擇，確定了GTO 為后續試驗的反應底物。

2.4 溫度對產物取代度的影響

溫度對產物取代度的影響見圖4。

圖4 溫度對產物取代度的影響Fig.4 Effect of temperature on the substitution degree of product

如圖4 所示，反應溫度低于65 ℃時隨著反應體系中溫度不斷升高，取代度隨溫度升高而逐漸增加，65 ℃時達到最大，繼續升高溫度后取代度隨溫度升高而降低。這可能是因為反應溫度的上升加劇了酶與底物之間的相互碰撞，促使反應向有利于脂肪酸淀粉酯合成的方向進行。繼續升溫后過高的反應溫度可能會影響酶的穩定性，降低酶活性使反應速率降低。因此，反應條件以65 ℃為宜。

2.5 時間對產物取代度的影響

反應時間對產物取代度的影響見圖5。

圖5 反應時間對產物取代度的影響Fig.5 Effect of reaction time on the substitution degree of product

如圖5 所示，反應時間在1.5 h 以內時，取代度隨時間增加而逐漸增大，1.5 h 時產物取代度達到最大值，此時反應體系中主要進行有利于產物合成的轉酯反應，產物脂肪酸淀粉酯逐漸積累，反應不斷向正向進行。后隨著反應時間的延長，取代度呈現出減小趨勢，出現這種情況可能是由于轉酯反應逐漸趨于平穩后，產物積累的同時有副產物水生成，脂肪酸淀粉酯可能發生水解反應，隨時間增加產物不斷被消耗，造成產物取代度下降。因此，反應時間以1.5 h 為宜。

2.6 GTO添加量對產物取代度的影響

GTO 添加量對產物取代度的影響見圖6。

圖6 GTO 添加量對產物取代度的影響Fig.6 Effect of GTO added amount on the substitution degree of product

如圖6 所示，GTO 添加量小于20 g 時，取代度隨GTO 含量增加而增大，GTO 添加量20 g 時取代度達到最大，此后在增加GTO 添加量取代度則開始下降。這可能是因為酰基供體的含量的增加使反應向著有利于脂肪酸甘油酯合成的方向進行。當添加量超過20 g時取代度降低可能是因為反應體系的黏度增大，流動性降低，影響了底物與酶催化活性中心的接觸[15]，降使取代度減小。因此，反應條件以GTO 添加量20 g 為宜。

2.7 酶添加量對產物取代度的影響

酶添加量對產物取代度的影響見圖7。

圖7 酶添加量對產物取代度的影響Fig.7 Effect of lipase added amount on the substitution degree of product

如圖7 所示，酶添加量在5%以內時，取代度隨著酶含量的增加逐漸增大，添加量為5%時取代度達到最大值，繼續增加酶取代度則基本不變。這可能是因為反應體系中的酶與底物的接觸更充分，使反應向著有利于脂肪酸甘油酯合成的方向進行，所以取代度更高，繼續增加酶含量取代度不再增加甚至略有下降，可能是過多的酶發生團聚影響了與底物的反應。因此，反應條件以酶添加量5%為宜。

2.8 正交試驗法確定微波輻射催化酶合成脂肪酸淀粉酯最優條件

各因素之間存在的復雜的交互作用會影響酶合成脂肪酸淀粉酯。為了優化合成條件，在單因素基礎上采用L9（34）正交試驗研究反應時間、反應溫度、GTO添加量、酶添加量4 個因素對脂肪酸淀粉酯的取代度的影響見表2。

表2 正交試驗表Table 2 Orthogonal test table

由表2 可以得出影響脂肪酸玉米淀粉酯取代度的主次因素順序為：反應溫度＞反應時間＞酶添加量＞GTO 添加量。采用L9（34）正交試驗分析得出微波輻射酶促脂肪酸淀粉酯合成的最佳反應條件為：反應溫度為 60 ℃，反應時間為 2.0 h，GTO 添加量為 20 g，酶添加量5%，在該反應條件下的取代度為0.034 6。

3 結論

本文對催化合成脂肪酸酯反應的淀粉的預處理方法、酶種類和酰基供體種類進行篩選，確定超聲波處理為最佳的底物處理方法，N435 脂肪酶作為生物催化劑，三油酸甘油酯為反應的酰基供體。對反應體系進行了條件優化，研究了反應時間、反應溫度、三油酸甘油酯添加量和酶添加量等因素的影響，得出酶添加量 5%，反應時間 2.0 h，GTO 添加量 20 g，溫度 60 ℃為最佳反應條件。在最佳反應條件下得到最終產品的取代度為0.034 6。