下一代測序技術在結直腸癌診療中的應用

陳如萍，劉蕊

結直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界第三大常見的惡性腫瘤，發病率和病死率分別位于全球癌癥第 3 位和第 2 位［1］。我國 CRC 患者亦呈逐年上升趨勢。腸鏡檢查是腸道腫瘤最有效的篩查方式，但由于我國腸鏡篩查還不夠普及，CRC 早期確診病例占比低，不能及時發現并干預，導致5年生存率低于發達國家。如今，臨床對更具優勢的遺傳學篩查和檢測技術的需求日益增長。下一代測序（next generation sequencing，NGS）技術是大規模平行測序技術的總稱，其檢測通量高、速度快、準確度高且信息量豐富［2］。大規模的基因組測序提高了人們對核酸功能的理解，利用NGS 鑒定大量突變位點更加切合實際［3］。因此，NGS 用于CRC 的篩查、診斷、治療及預后判斷具有較大的應用價值與前景。在臨床實踐中通過單次測序即可同時獲得與CRC 有關的多個基因序列或全基因組信息，從而有助于臨床決策的制定［4］。

1 遺傳性CRC基因攜帶者的篩查

1.1 CRC的常見突變基因 體細胞基因突變，尤其是驅動基因突變導致的癌基因激活或抑癌基因失活，在惡性腫瘤的起始、發展和轉移過程中起關鍵作用［5］。具有明確遺傳基因突變的CRC僅占全部病例的5%左右，如Lynch 綜合征（Lynch syndrome，LS）、家族性腺瘤性息肉?。╢amilial adenomatous polyposis，FAP）、Gardner綜合征、P-J綜合征等，若直系親屬有上述病史，建議利用NGS檢查相應基因，以實現CRC的早期干預［6］。

癌癥基因組圖譜計劃（the cancer genome atlas，TCGA）顯示，在CRC 腫瘤標本中除了已知的APC、TP53、RAS（KRAS、NRAS）、BRAF、PIK3CA等常見突變外，ARID1A、SOX9、FAM123B/WTX、CD44、DCC等突變及HER2、IGF2等擴增的頻率也較高［7］。Díaz-Gay 等［8］對特定CRC 的全外顯子組測序數據綜合分析，得出BRCA2、BLM、ERCC2、RECQL、REV3L和RIF1是參與種系突變導致家族性CRC 易感性的潛在候選基因。

遺傳性 CRC 最多見的是 LS、FAP 和 MUTYH 相關性息肉?。∕UTYH-associated polyposis，MAP），分別表現為DNA 錯配修復（mismatch repair，MMR）基因（MLH1、MSH2、MSH6、PMS1、PMS2）、APC、MUTYH突變。LS占CRC病例的2%～5%，Lynch陽性者患大腸癌的風險高達80%，其主要分子基礎是MMR突變，進而導致大范圍微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）［9］?！哆z傳性結直腸癌臨床診治和家系管理中國專家共識（2018）》建議：初診CRC 患者應檢測微衛星狀態，初篩為MSI 則應行MMR和EPCAM檢測。NGS 能夠識別突變基因，聯合NGS 與生物信息學、細胞和分子生物學以及動物模型等功能基因組學方法有利于推動對多種遺傳突變體致病性的解釋［10］。臨床可利用NGS 進行突變基因篩查，作為早期發現CRC的方法之一。

1.2 NGS用于CRC基因突變檢測的臨床價值 NGS逐漸成為腫瘤分子診斷的有力工具［11］。Bai 等［12］強調了靶向NGS 的重要性，通過Ion Torrent 測序平臺分析 91 例直腸癌，結果顯示KRAS、TP53、APC、FBXW7、PIK3CA頻繁突變，BRAF、CTNNB1、ERBB2和SMAD4突變程度較輕；該研究還發現多重突變，主要涉及KRAS和APC或KRAS和TP53。Zhang等［13］利用基于逆轉錄探針的靶向NGS鑒定來自中國的早發性或家族性CRC 患者的高外顯率種系突變，該方法可識別7 種CRC 易感基因的突變，包括APC、MLH1、MSH2、MSH6、PMS2、MUTYH和NTHL1，此方法的敏感度（99%）和特異度（98%）均較高。

黃凱等［14］使用多重 PCR 靶向富集結合 NGS 技術對17例CRC病例和14例正常樣本的MMR基因進行檢測，在外顯子區域共發現15 種突變，與Sanger測序驗證結果一致，而NGS更節約時間和成本，說明該技術適合MMR基因突變篩查。李麗娟等［15］使用Ion Torrent測序儀檢測108例CRC病理樣本的KRAS基因狀態，并與作為金標準的Sanger測序比較，符合率為94%，特異度為91.5%，敏感度高達100%，證實了 NGS 的臨床應用價值。同樣，Gao 等［16］使用 Ion Torrent PGM 系統測定 51 例 CRC 組織的KRAS突變，該系統針對KRAS外顯子2 突變（13/51）顯示出與Sanger 測序100%的一致性，特異度和敏感度均較高，適用于臨床常規檢測。Wang等［17］驗證基于擴增子的靶向NGS對CRC組織的分析性能，在中值測序深度≥500 X 時，特異度為100%，敏感度為95%～100%；隨后，在大型多中心研究中獲得648 例中國CRC 患者的突變譜，鑒定出TP53（52.82%）、KRAS（46.68%）、APC（24.09%）、PIK3CA（18.94%）、SMAD4（9.47%）、BRAF（6.15%）、FBXW7（5.32%）、NRAS（4.15%）以及其他不常見的突變基因；此外，檢測到特定突變基因與某些臨床病理學特征具有相關性，如BRAF和PIK3CA在右半結腸癌中更普遍。以上研究明確了NGS 應用于CRC 突變基因檢測的可行性、準確性和實用性。

2 轉移性結直腸癌（mCRC）的靶向治療

2.1 mCRC 的抗表皮生長因子受體（epithelial growth factor receptor，EGFR）治療 EGFR 的活化可激活 Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK 和 PI3K/AKT/mTOR兩條胞內信號傳導通路，在細胞生長、增殖、遷移和血管生成等過程中發揮重要作用。EGFR 通路在惡性腫瘤中可過表達或異常激活，與腫瘤進展和預后有關，因而成為治療的有效靶點。該通路可由KRAS、NRAS、BRAF或PIK3CA的突變持續激活，導致mCRC 患者對抗EGFR 單克隆抗體治療的耐藥［18-19］。此時，可以根據腫瘤組織的基因分型來指導靶向治療。

在眾多基因中，KRAS與CRC 高度相關，30%～40%的CRC 患者伴有該基因突變。KRAS基因已被《NCCN臨床實踐指南》列為CRC靶向治療的必檢項目，mCRC 患者需先檢測該基因突變情況繼而指導臨床用藥。如KRAS突變介導抗EGFR單抗的耐藥，則患者不應接受抗EGFR 治療。同樣，《ESMO 共識指南》建議在抗EGFR 藥物治療前對KRAS和NRAS的外顯子2、3和4以及BRAF的外顯子15進行檢測，不建議突變者使用上述靶向藥物［20］。目前針對RAS突變型腸癌，抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單抗聯合化療仍是主要治療手段。

由于靶向治療的復雜耐藥機制，許多患者會對指南推薦的治療藥物產生耐受。Hou 等［21］針對57例中國CRC患者的508種腫瘤相關基因行基于雜交捕獲的靶向NGS，該研究中突變最頻繁的基因是APC（68.4%）、TP53（56.1%）和KRAS（52.6%）；57.9%的 CRC 患者存在KRAS、NRAS和BRAF突變，17.5%具有上述基因野生型的患者存在PTEN、PIK3CA和HER2突變；在12.3%的患者中鑒定出HER2擴增，可誘導下游信號激活并導致西妥昔單抗或帕尼單抗耐藥，因而無法從抗EGFR 治療中獲益；此外，EGFR、FGFR1、PDGFRA和MAP2K1突 變 也 被 認 為 是 抗EGFR耐藥的主要潛在機制。由此可知，NGS或可成為判斷腫瘤突變譜以指導晚期CRC 患者個體化治療的關鍵。

2.2 局部晚期病例的新輔助化療 局部晚期CRC的標準療法包括新輔助化療（neoadjuvant chemotherapy，NACT），NACT 聯用靶向藥物可為患者帶來生存獲益，但此方法并非適合所有患者。對于是否需要實施NACT 聯合靶向治療，應先進行腫瘤組織的基因突變檢測，再結合各項檢查結果、患者病情進展等具體情況進行綜合評估。

目前，腫瘤內異質性（intratumoral heterogeneity，ITH）已被認為是化療和放療抵抗的機制?；谕蛔兊任换蚰[瘤異質性（mutant-allele tumor heterogeneity，MATH）的NGS 算法可作為衡量ITH 的指標，為CRC 的靶向治療提供潛在的生物標志物［22-24］。Greenbaum等［25］應用NGS檢測局部晚期直腸癌患者ITH 與NACT 療效之間的相關性，證明了較高的MATH 評分與NACT 較差的治療反應有關。由此可見，術前使用NGS進行分子篩選，通過MATH值量化腫瘤異質性程度，便于臨床醫生為患者制定更加合理有效的治療方案。

3 CRC的療效預測及預后

3.1 聯合RAS、BRAF檢測 NGS 技術對 CRC 的療效預測及預后有一定的指導意義，有助于臨床醫生進行隨訪和管理。在mCRC的常規化療中加入靶向藥物可提高療效，對于RAS/BRAF野生型病例，GALGB 80405Ⅲ期研究提示西妥昔單抗更宜聯合FOLFOX（奧沙利鉑+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶），貝伐珠單抗更宜聯合FOLFIRI（伊立替康+亞葉酸鈣+5-氟尿嘧啶），左半結腸癌患者的預后較好［26］。臨床研究表明，若采用EGFR 單抗治療，RAS、BRAF的突變狀態會影響治療策略的有效性，被推薦為預測抗EGFR 療效的重要指標，使用抗EGFR 治療的RAS/BRAF野生型患者的應答率（response rate，RR）、無進展生存期（progression-free survival，PFS）和總體生存期（overall survival，OS）均有改善，但在左右半結腸癌療效差異的問題上仍存在爭議［27-28］。

Vidal 等［29］利用 NGS 評估抗 EGFR 治療聯合化療 時RAS、BRAF、PIK3CA和EGFRS492R突 變 的mCRC患者的療效，發現4種基因均為野生型的患者反應良好。Gong等［30］從138例mCRC中鑒定出一種新型KRAS突變（KRASR68S1），與預后較差有關。Jones 等［31］對 9 643 例 mCRC 行 NGS，旨在評價非V600BRAF突變的影響，在接受檢查的患者中，非V600 突變比例為2.2%（208 例），占全部BRAF突變的22%，與CRC亞型明顯相關且預后較好，表明NGS在mCRC的預后評估中具有重要參考價值。

Taieb等［32］采用AmpliSeq分析PETACC8臨床試驗（FOLFOX+/-西妥昔單抗）中2 559 例Ⅲ期CRC 病例的RAS和BRAFV600E 突變，明確 908 例為陽性，其余1 651 例中有1 054 例進行了NGS 檢測，分別有227 例（21.5%）和46 例（4.4%）新診斷為KRAS/NRAS和BRAF突變，使用FOLFOX+西妥昔單抗治療的RAS/BRAF野生型患者預后較好。隨后，Bruera等［33］采用Ion Torrent 對一線FIr-B/FOx（5-氟尿嘧啶與交替伊立替康/BEV 或奧沙利鉑）+貝伐珠單抗三聯化療的mCRC 患者行KRAS/NRAS/BRAF分析，結果顯示KRAS外顯子 2～4（KRAS2～4）、NRAS外顯子 2～4（NRAS2～4）、BRAF外顯子15（BRAF15）突變體普遍存在。Yang 等［34］對 1 例KRAS/NRAS/BRAF野生型mCRC 患者建立患者源性異種移植模型，經NGS 檢測出HER2擴增以及激活突變S310F，試驗顯示阿法替尼療效顯著，后續隨訪該患者達到3 個月PFS 和臨床癥狀緩解，且無嚴重的不良反應。以上研究進一步表明高敏感度的NGS能夠動態監測基因突變譜的變化，據此可對治療方案進行實時調整，從而更密切地預測療效和預后。

3.2 聯合MSI 檢測 微衛星高度不穩定性（microsatellite instability-high，MSI-H）已是公認的Ⅱ期CRC 的預后及化療療效預測因子。具有MSIH 表型的Ⅱ期CRC 患者預后較好，不建議使用氟尿嘧啶類單藥輔助治療［35-36］。近年來，NGS 的進步實現了MSI狀態的檢測［37］。Kim等［38］探討靶向NGS對MSI的識別能力，分析382個具有已知MSI的CRC樣本，鑒定出驗證組的8個MSI-H，選擇體細胞突變負荷截斷值≥40 且I 指數≥9%作為檢測標準具有較高的敏感度和特異度。另外，為了探究MSI 的預后價值，Innocenti 等［39］在貝伐珠單抗聯合化療或西妥昔單抗聯合化療的一線治療mCRC 患者的療效研究（CALGB/SWOG 80405）中利用NGS評估貝伐珠單抗與西妥昔單抗的療效差異，結果表明，對存在MSI-H的患者而言，貝伐珠單抗組比西妥昔單抗組的OS更長。若貝伐珠單抗聯合化療的益處得到進一步證實，該方案有望改善mCRC的預后。

3.3 聯合外周血循環腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）檢測 NGS 技術所用的檢測標本大多為腫瘤組織，有創且難以反復獲取。然而，ctDNA可以先于影像學檢查提示腫瘤復發及轉移，基于ctDNA的NGS算法也能為腫瘤組織取樣困難或不足的晚期CRC患者提供新的選擇［40］。Osumi等［41］指明了ctDNA在CRC預后中的意義，表現為CRC的療效評估、復發轉移預測以及耐藥監測等方面。Zhang等［42］利用 NGS 測定西妥昔單抗治療的 15 例 CRC 患者外周血ctDNA 并以微滴式數字PCR 作為對照，NGS 的敏感度和特異度分別為87.5%和100%。基于NGS 的ctDNA 檢測在鑒定基因組變異時更具優勢，可用于CRC 患者西妥昔單抗治療期間的實時監測。

近年來，基因組學的進展拓寬了NGS 技術從基礎科研到臨床實踐中的應用。NGS技術不僅有助于闡明CRC 的發病機制，而且能夠提供相關基因位點的突變信息，從而用于篩查高危人群，實現早期診斷，指導精準治療，判斷療效及預后。雖然NGS仍處于起步階段，但前期研究已顯示其良好的應用前景。相信隨著高通量測序數據庫的建立、法律法規的完善以及統一檢測標準的制定，NGS 將會更廣泛地應用于臨床，為CRC的診療提供參考。