葛仙米化學成分及生理活性研究進展

易思富，田云，*

（1.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南長沙410128；2.常德炎帝生物科技有限公司，湖南常德415707）

葛仙米是一種屬于藍藻門（Cyanophyta）、藍藻綱（Cyanophyceae）、段殖藻目（Hormogonales）、念珠藻科（Nostocaceae）、念珠藻屬（Nostoc）的低等單細胞藍藻，俗稱天仙米、天仙菜、水木耳、田木耳、珍珠菜，學名為球狀念珠藻（Nostoc sphaeroids kützing）[1]。葛仙米的食用歷史悠久，相傳東晉時期葛洪在災荒之年采之為食，偶獲健體之功能，隨后葛洪入朝將之獻給皇上，體弱太子食后病除體壯，皇上為感謝葛洪之功賜名為“葛仙米”，并沿用至今。

葛仙米藻體呈膠質狀、球狀或其它不規則形狀，顏色為藍綠色或黃褐色；細胞球形，一般由多數細胞連成念珠狀群體，外包膠質。葛仙米一般生長在水稻田、淺水池沼湖、溪的砂石間或陰濕的泥土中。目前世界上野生葛仙米的分布已十分稀少，產量很低，湖北省鶴峰縣走馬坪鎮是我國葛仙米的主要分布地。葛仙米在我國已有1500 多年的食用和藥用歷史，據《本草綱目拾遺》記載：葛仙米，出勾漏草澤間。采得曝干，仍漬以水，可作羹入饌，味甚鮮；初取時如小鮮木耳，紫綠色，以醋拌之，肥脆可食，干則以水浸之，與肉同煮，作木真味。另據《全國中草藥匯編》（第2 版）介紹，葛仙米“淡、寒，清熱、收斂、益氣、明目，主治夜盲癥、脫肛；外用治燒燙傷”[2]。現有研究表明：葛仙米中含有蛋白質、氨基酸、多糖、脂肪酸、多種維生素以及礦質元素等營養成分和活性物質[3-27]，具有如抗氧化、抑菌消炎、增強免疫、抑制腫瘤、調節膽固醇代謝以及抗凝血等生理活性[28-43]。2017 年，湖南炎帝生物工程有限公司向國家衛生健康委員會提交了關于球狀念珠藻（葛仙米）（衛食新申字（2017）第0009 號）的行政許可申請，根據《食品安全法》和《新食品原料安全性審查管理辦法》，經國家衛生健康委員會審查通過（衛食新通字（2018）第0001 號）并已公告（國家衛生健康委員會衛生行政許可公告2018 年第10 號），葛仙米正式列入國家新食品原料名錄[44]。本文在此基礎之上，系統綜述了國內外有關葛仙米化學成分及其主要生理活性的相關研究，為葛仙米的進一步合理開發利用提供重要指導和參考。

1 葛仙米主要化學成分

1.1 營養成分

葛仙米營養成分豐富，富含蛋白質和多糖類成分，氨基酸組成合理、配比均衡。劉金龍最早對湖北省鶴峰縣的葛仙米干品進行了營養成分分析，發現葛仙米中蛋白質含量高達52%，總氨基酸含量為93.72 g/100 g蛋白質，其中6 種必需氨基酸占總氨基酸的42.3%，維生素C、維生素B1和維生素B2的含量分別為521、2.63、0.58 mg/100 g，并含有如鐵、鈣、鉀等多種有益人體健康的微量元素[3]。夏建榮等通過分析卻發現葛仙米中的蛋白質、氨基酸、總糖、粗脂肪和灰分的含量分別為28.38%、23.35%、24.19%、5.34%和14.63%[4]。汪興平等比較分析了室內培養與野生葛仙米之間營養成分的差異，發現粗蛋白（分別為47.83%和48.61%）、粗脂肪（分別為7.28%和8.11%）、碳水化合物（分別為14.3%和12.69%）、維生素C（分別為 5.31 mg/g 和5.50 mg/g）和粗灰分（分別為9.56%和10.88%）等成分之間并無顯著差別，都含有17 種氨基酸和人體7 種必需氨基酸，其中谷類蛋白質的第一和第二限制性氨基酸——賴氨酸和蘇氨酸的含量較高，脂肪酸組成沒有差異，都以中碳鏈為主，都富含多種維生素。與室內培養葛仙米相比，野生葛仙米中絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸和谷氨酸含量下降，而甘氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、精氨酸和半胱氨酸含量則上升，各種脂肪酸含量增加，B 族維生素含量低，維生素C、維生素E 和β-胡蘿卜素含量稍高[5-6]。方倩等分析了葛仙米中11 種礦質元素的含量，發現鈣的含量高達55 878.69 mg/kg，另外鉀、鎂和鈉等含量也較高，而鎘、鉻等有害重金屬含量都遠低于國家規定的標準[7]。梅邢等探討了微波爐、電磁爐和高壓鍋3 種不同加工方式對葛仙米營養成分的影響，發現經過加工處理后葛仙米中的總蛋白、脂肪、糖類和灰分等成分的含量都發生不同程度的降低，單糖組成也發生變化，甘露糖、葡萄糖和葡萄糖醛酸消失，產生了半乳糖醛酸。高壓鍋處理后葛仙米中氨基酸和必需氨基酸的保留率分別達到96.92%和97.31%[8]。

1.2 揮發性成分

程超等首先從未經熟制的葛仙米中檢測到48 種揮發性物質，主要為 14 種烷烴類（42.151%）、10 種酸類（27.590%）和 11 種酯類（26.571%）物質，隨后分析了微波爐、高壓鍋和電磁爐3 種不同烹調方式對其風味成分的影響，發現經微波爐、高壓鍋和電磁爐熟制后，葛仙米中分別僅含有16、16 和8 種揮發性物質；微波爐和高壓鍋熟制后，酯類物質的含量達到50%以上，而烷烴類物質的含量則下降到2.4%～3.1%；電磁爐熟制后則未檢測到酯類物質，烷烴類物質也下降約一半。由于酯類物質大多具有酯的芳香氣味，因此，經微波爐和高壓鍋熟制后的葛仙米更具有清香味[9]。

1.3 多糖

多糖是葛仙米中重要的活性物質之一，具有水溶性好、低濃度高黏度、穩定性優等特性[10-11]，因此，對葛仙米多糖的提取、鑒定以及特性分析引起了大家的關注。莫開菊等和鄧伊苓等分別探討和優化了葛仙米多糖的提取工藝，獲得了一致的結果，水溶性多糖提取方法是：90 ℃，6 h，1 ∶90（mg/mL）加水，水提取 4 次，其中提取次數是對多糖提取影響較大的因素；堿溶性多糖提取方法是：1 mol/L 的 NaOH 溶液，6 h，1 ∶25（mg/mL）加堿，提取4 次，其中提取次數和堿液濃度是影響多糖提取較大的因素，所提取的水溶性多糖和堿溶性多糖都具有一般多糖的特征[12-13]。

莫開菊等采用熱水浸提乙醇沉淀方法從葛仙米中提取純化出多糖，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法和HPLC-質譜聯用法測定葛仙米多糖提取物的單糖組成，經分析發現所提取的葛仙米多糖中單糖組成摩爾比甘露糖∶葡萄糖醛酸∶葡萄糖 ∶半乳糖 ∶阿拉伯糖為 1 ∶1.12 ∶3.24 ∶1.72 ∶1.21[14]。蘇攀峰等以室內人工培養的葛仙米為原料，采用熱水浸提乙醇沉淀法提取其多糖，提取物中多糖含量為96.95%，平均分子量為1.324×102kDa，單糖組成和摩爾比阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖為 1 ∶6.73 ∶10.84 ∶5.27 ∶4.88 ∶3.92；多糖溶液的黏度隨著質量濃度的增加而升高，隨著剪切速率的增大而降低，具有剪切稀釋的特性，是典型的假塑性非牛頓流體；在20 ℃～80 ℃范圍內，多糖溶液的黏度隨著溫度的升高而降低；當溶液為中性（pH 7）時，多糖溶液的黏度達到最大；0.02 mol/L 的維生素C 和0.1 mol/L的H2O2都能降低多糖溶液的黏度；在0.1 Hz～10 Hz 的掃描頻率內，儲能模量（G'）和損耗模量（G″）將隨著多糖溶液質量濃度的增加而增大，因此，增加多糖溶液的質量濃度能夠增大其成膠趨勢和彈性特性；葛仙米多糖與透明質酸具有協同增稠的作用，具有在化妝品方面應用的潛力[15]。LIU 等以葛仙米為材料，采用熱水浸提40%乙醇沉淀提取純化到水溶性葛仙米多糖，產量約為40.10%。葛仙米多糖提取物中可溶性糖的含量高達97.86%，平均分子量為 1.31×105g/mol，ρ 值為1.50，說明其水溶液中存在柔性的無規則卷曲構象，多糖提取物中單糖成分的摩爾比甘露糖∶葡萄糖∶木糖∶半乳糖 ∶葡萄糖醛酸為 1.00 ∶1.92 ∶0.97 ∶1.02 ∶0.91[16]。LI 等以人工培養的葛仙米為材料，依次經過風干、研磨、乙醇回流、離心收集沉淀、水浸泡過夜、熱水提取、木瓜蛋白酶消化、乙醇沉淀、復溶、透析、冷凍干燥等過程制備成葛仙米多糖提取物，其可溶性多糖含量約80%，分子量平均值為1.99×103kDa。該多糖提取物中含有34.5%甘露糖、21.8%果糖、14.6%半乳糖、17.7%葡萄糖、6.1%木糖、2.2%鼠李糖和3.1%半乳糖醛酸。該多糖提取物具有多糖典型的紅外吸收光譜特征和表面粗糙的非晶形態，具備較強的吸濕保水能力和較高的相對黏度[17]。朱玉婷等研究了葛仙米多糖的硫酸酯化修飾工藝，發現采用氯磺酸-吡啶法進行葛仙米多糖硫酸酯化修飾的最佳條件是：V氯磺酸∶V吡啶比例為1 ∶4，反應溫度是 70 ℃、反應時間為 6 h，在此條件下獲得的產物取代度達到1.042，具有硫酸酯鍵的特征吸收峰[18]。

1.4 藻膽蛋白

葛仙米中藻膽蛋白（phycobiliprotein，PBP）含量豐富，主要包括藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）和藻藍蛋白（phycocyanin，PC）等。最早汪興平等先用反復凍融法破除葛仙米的細胞壁，即將葛仙米粉在0 ℃條件下放置0.5 h 后再進行研磨，重復3 次后提取，進一步采用正交旋轉組合實驗對藻膽蛋白提取工藝進行優化，確定了葛仙米藻膽蛋白的最佳提取條件是：在含0.21 mol/L NaCl 的pH 7.3 的磷酸鹽緩沖液中浸提4.3 h，在該條件下藻膽蛋白的得率為7.125%[19-21]；進一步采用層析、電泳、質譜等技術從中分離純化鑒定出葛仙米藻藍蛋白和藻紅蛋白，發現藻藍蛋白和藻紅蛋白都主要以α-螺旋結構為主，藻膽蛋白在40 ℃以下，酒精濃度40%以下，pH 值在5～8 的范圍內比較穩定[21-23]。余佳等獲得的超聲輔助提取葛仙米藻膽蛋白的工藝是：超聲功率700 W、葛仙米粒徑數120 目～200目、液料比 58 ∶1（mL/g）、提取溫度為 42 ℃、提取時間為6 h，此時葛仙米藻膽蛋白的提取率為26.13%，進一步利用一步離子交換層析獲得了純度分別達83.5%的藻紅蛋白和93%的藻藍蛋白[24]。田盼盼等利用逐級鹽析法結合雙水相萃取從葛仙米中提取、純化并鑒定出藻藍蛋白，建立了藻藍蛋白提取工藝：先用20%的（NH4）2SO4進行鹽析，離心去沉淀，上清液然后用40%和50%的（NH4）2SO4鹽析獲得藻藍蛋白，最后用10%的聚乙二醇 6000 和18%的（NH4）2SO4進行雙水相萃取，所得藻藍蛋白產物純度達到8.6，回收率為71.40%[25]。

1.5 脂肪

葛仙米中脂肪含量比較少，相關研究報道也不多。PARK 等以新鮮葛仙米為材料，經過冷凍干燥、研磨、氯仿/甲醇振蕩提取獲得葛仙米脂質提取物，該提取物中包含有色素、游離脂肪酸、甘油三酯、維生素E和蠟酯等成分，其中游離脂肪酸的含量約為15%，游離脂肪酸中包含有26%棕櫚酸、24%棕櫚油酸、16%亞油酸和25%亞麻酸，色素主要為β-胡蘿卜素，含量為 70 mg/100 g 干重[26]。

1.6 其它物質

在自然環境中，葛仙米在干燥和再水合狀態之間周期性重復，在干燥階段，葛仙米經受如干燥、熱、紫外線和氧化等各種脅迫，因此，葛仙米自身也發展出不同的機制來耐受這些脅迫環境。葛仙米耐受紫外線的機制之一是能夠產生類菌胞素氨基酸（mycosporinelike amino acid，MAA）物質，研究人員從葛仙米中分離純化并鑒定出一個具有防紫外線功能的新型糖基化MAA——13-O-β-半乳糖基-卟啉-334（13-O-βgalactosyl-porphyra-334，β-Gal-P334），β-Gal-P334 在334 nm 處有最大吸收值[27]。

2 葛仙米主要生理活性

2.1 抗氧化活性

葛仙米中存在多種具有抗氧化活性的成分，如藻膽蛋白和多糖等。汪興平等在對葛仙米藻紅蛋白進行提取、分離與純化基礎之上，發現葛仙米藻紅蛋白在體外具有清除氧自由基的能力[28]；隨后發現藻藍蛋白能夠有效減少肝臟和血液中丙二醛及過氧化物的含量，并發現反復凍融的破壁處理方法和磷酸緩沖液作為提取液都能明顯增強藻膽蛋白的抗氧化能力[29-31]。TANG 等以葛仙米為材料，采用水溶醇沉的方法提取多糖（可溶性糖含量為46.2%），該多糖提取物對超氧陰離子、羥自由基具有有效的清除能力，對脂質過氧化具有抑制作用，并對人胚腎細胞293 中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶等抗氧化酶的活性具有促進作用[32]；LI 等以百草枯引起的氧化脅迫線蟲為模型，發現葛仙米多糖提取物能夠抑制線蟲在脅迫條件下活性氧的產生，減少蛋白質羰基化和脂質過氧化，激活超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，從而提高線蟲在氧化脅迫下的存活率[17]，因此，葛仙米多糖是食品和制藥工業中天然抗氧化劑的潛在來源。ISHIHARA 等以人角質細胞系HaCaT 為材料，發現葛仙米中的MAA 物質β-Gal-P334 在長波紫外線（ultraviolet radiation a，UVA）和中波紫外線（ultraviolet radiation b，UVB）誘導的細胞損傷中都具有保護作用，采用比色法和電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）法證明β-Gal-P334 還具有抗氧化活性，因此，β-Gal-P334 可以作為化妝品和盥洗用品的潛在原料進行開發利用[27]。

2.2 抗菌消炎活性

常向東等首先從葛仙米中提取水溶性多糖，然后采用濾紙貼片法分析了水溶性多糖的抑菌活性，結果表明葛仙米水溶性多糖對綠膿桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和黑曲霉菌都有抑制作用，其中對綠膿桿菌的抑制能力最強，說明葛仙米可以作為新型抗菌藥物和植物防腐劑進行開發[33]。PARK 等以RAW 264.7巨噬細胞為模型，發現葛仙米脂質提取物能夠抑制促炎介質如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、環氧合酶 2（cyclooxygenase 2，COX-2）、白細胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達，減少 TNF-α 和 IL-1β 的分泌，降低核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的DNA 結合能力；脂質提取物中的游離脂肪酸也能抑制TNF-α、COX-2 的表達，但效果沒有脂質提取物顯著，說明葛仙米脂質提取物中還含有除游離脂肪酸以外的具有抗炎特性的其他生物活性化合物[26]。隨后，KU 等采用葛仙米脂質提取物對RAW 264.7 巨噬細胞進行預處理，發現其對脂多糖誘導的TNFα、IL-1β 和IL-6 的表達具有抑制作用，引起TNFα、IL-6、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony-stimulating factor，GCSF）、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF） 以及單核細胞趨化因子1（monocyte chemoattractant protein 1，MCP-1）分泌的減少；從飲食中添加葛仙米脂質提取物喂養的載脂蛋白E 敲除（ApoE-/-）小鼠中分離出脾細胞，發現其中的IL-6 的表達水平也明顯降低，說明葛仙米脂質提取物對促炎細胞因子的表達和分泌均具有抑制作用[34]。這些研究結果為抗炎藥物的研發提供重要依據。

2.3 增強免疫活性

Yang 等先后以 HepG2 細胞和 4 周齡 C57BL/6J 小鼠為材料，對葛仙米的己烷、氯仿、甲醇和水提物進行體外和體內的安全性評價，結果表明：添加葛仙米提取物的細胞培養物中不含有微藻毒素，并且對細胞的毒性非常小；在小鼠飲食中長時間添加葛仙米提取物也沒有引起明顯的副作用。說明葛仙米可開發為對健康有益的安全天然食品[35]。程超等探討了葛仙米藻膽蛋白對昆明小鼠免疫功能的影響，發現葛仙米藻膽蛋白可以提高小鼠中腹腔巨噬細胞吞噬率、自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性、T 淋巴系統增殖以及血清中白細胞介素（interleukin-2，IL-2）和 IL-4 細胞因子的表達水平，還能提高小鼠的遲發型超敏反應（delayed type hypersensitivity，DTH）[36]；LIU 等發現葛仙米多糖提取物能夠刺激RAW264.7 巨噬細胞中NO 的釋放[16]。這些結果表明葛仙米藻膽蛋白和多糖都具有強大的免疫增強生物活性，可以作為一種潛在的免疫增強劑進行開發利用。

2.4 抑制腫瘤活性

莫開菊等通過建立S180昆明雌性腫瘤小鼠模型，分析了葛仙米多糖在體內的抑瘤效果和對免疫能力的影響，發現葛仙米多糖能夠顯著抑制小鼠腫瘤的生長，且抑瘤效率呈劑量效應；對腫瘤所致的小鼠細胞免疫力如脾淋巴細胞轉化、NK 細胞活性、DTH 下降等都有顯著的抑制作用，對重要免疫器官胸腺具有一定的抑制作用，但是對腎臟指數、肝臟指數以及血液和肝臟中的氧化指標沒有明顯影響[37]。湯俊等以人肝癌HepG2 細胞株為模型，探討了葛仙米甲醇提取物的抗腫瘤活性，結果表明，葛仙米甲醇提取物能夠有效抑制人肝癌HepG2 細胞的生長，通過采用形態學、Annexin V/PI 雙染以及碘化丙啶單染流式細胞術法檢測，證明葛仙米甲醇提取物能夠顯著誘導肝癌細胞HepG2 的凋亡[38]。LI 等發現葛仙米多糖提取物能夠抑制 A549、HepG2、PC3、MCF-7 和 Jurkat 等多種腫瘤細胞的增殖，在人肺癌A549 細胞中，還能通過激活caspase-3 途徑誘導細胞凋亡[17]。

2.5 調節膽固醇代謝活性

為了探討葛仙米對膽固醇代謝的作用，RASMUSSEN 等以HepG2 細胞為材料，通過添加不同濃度的葛仙米脂質提取物，發現葛仙米脂質提取物能夠顯著降低細胞中3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A 還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR） 和低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）在mRNA 和蛋白質水平上的表達，從而抑制膽固醇的合成；為了進一步分析葛仙米脂質提取物抑制HMGR 和LDLR 表達的分子機制，發現葛仙米脂質提取物能夠抑制甾醇調節因子結合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP）-1 和 SREBP-2 的成熟加工過程，降低SREBP-1 應答基因如脂肪酸合酶（fatty acid synthase，FAS） 和硬脂酰輔酶 A 去飽和酶 1（stearoyl CoA desaturase 1，SCD-1）的表達[39]。隨后，又以C57BL/6J 雄性小鼠為模型，分別通過短時間和長時間在飲食中添加葛仙米粉末進行飼養，發現葛仙米粉末能夠顯著降低血漿中總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglyceride，TG）的含量，抑制腸道對膽固醇的吸收，有助于甾醇從糞便中排泄出來；促進肝臟中 SREBP-2、HMGR、LDLR、SCD-1、乙酰輔酶 A 羧化酶 1（acetyl-CoA carboxylase 1，ACC-1）、肉毒堿棕櫚酰轉移酶 1α（carnitine palmitoyltransferase 1α，CPT-1α）和乙酰輔酶 A 氧化酶 1（acyl-CoA oxidase 1，ACOX-1）在mRNA 水平上的表達以及FAS 在蛋白質水平的積累[40-41]。KU 等以動脈粥樣硬化小鼠模型——載脂蛋白E 敲除（ApoE-/-）小鼠為材料，在飲食中連續12 周添加5%的葛仙米粉末，結果發現，通過在飲食中添加葛仙米粉末，小鼠血漿中TC 和TG 的含量都顯著降低，肝臟中TC 含量和脂質積累也明顯減少，FAS 的表達水平也降低，從而使主動脈病變發展程度降低[42]。因此，補充葛仙米可以通過減少腸道膽固醇吸收和促進甾醇排泄，降低動脈粥樣硬化病變的發生，說明其具有作為一種動脈粥樣硬化天然保護劑來進行開發利用的前景。

2.6 抗凝血活性

雖然葛仙米多糖本身沒有抗凝血活性，朱玉婷等通過分析不同取代度和不同濃度葛仙米多糖硫酸酯的抗凝血活性，發現葛仙米多糖的硫酸酯化產物具有抗凝血活性，隨著多糖中硫酸酯取代度的增大，活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplasting time，APTT）和凝血酶時間（thrombin time，TT）也隨之延長，并具有量效關系，但對凝血酶原時間（prothrombin time，PT）的作用不顯著，推測葛仙米多糖硫酸酯主要是通過抑制內源性凝血過程和共同凝血途徑從而發揮抗凝血作用，對外源凝血途徑的影響較小[43]。

3 展望

葛仙米營養價值豐富，食用藥用歷史悠久，具有多種生理活性，并已被國家列入新食品原料，因此，葛仙米具有非常廣闊的開發應用前景。目前，葛仙米的研究工作主要集中在藻膽蛋白和多糖等少數成分的分離提取與活性鑒定上，限制了葛仙米的開發與應用范圍。今后葛仙米的研究工作將主要集中在以下幾個方面：（1）優質葛仙米品種的選育及種質資源庫的建立。現有的葛仙米種質退化嚴重，性狀不佳，迫切需要選育一批抗逆性強、營養價值高且生長速度快的優良新品種或新品系；（2）進一步加強葛仙米活性成分的挖掘與作用機制研究，包括糖類物質的進一步分離純化與鑒定、MAA 等類似功能成分的鑒定、活性成分對生理功能的具體調節機制與調節網絡等，從而為葛仙米在功能性食品和藥品上的深度開發應用提供充分依據；（3）進一步拓寬葛仙米的應用價值，目前葛仙米主要是用于食品及其初加工產品，開發利用程度不高、附加值低、效益不顯著，最近研究人員將葛仙米用于個性化的3D 食品打印中[45]，拓寬了葛仙米的應用領域，也為今后提高葛仙米的合理開發利用程度提供借鑒。