應用孕婦血漿中胎兒游離DNA進行產前篩查的臨床研究進展

李曉洲，史云芳，琚端，李巖，張穎

孕婦血漿中的胎兒游離DNA（cell-free fetal DNA，cffDNA）可通過高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術即二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術進行精確檢測，并應用于胎兒染色體非整倍體疾病的無創產前檢測（noninvasive prenatal testing，NIPT）。目前NIPT 技術是指胎兒染色體非整倍體異常產前篩查技術，主要應用于21三體綜合征（trisomy 21 syndrome，T21）、18三體綜合征（trisomy 18 syndrome，T18）和13三體綜合征（trisomy 13 syndrome，T13）的產前篩查。隨著對cffDNA研究的不斷深入，其應用范圍已擴展至單基因遺傳性疾病、胎兒性別鑒定、胎兒Rh血型鑒定、胎兒染色體拷貝數變異（copy number variants，CNVs）等多個領域。而隨著NIPT臨床研究的不斷深入，尤其是對其假陽性、假陰性及檢測失敗病例的深入分析，臨床工作者對NIPT 的臨床應用范圍亦有了新的認識。本文就應用孕婦血漿中cffDNA 進行NIPT 的臨床研究進展及其影響因素進行綜述，為個體化、規范化應用NIPT技術提供參考。

1 胎兒染色體非整倍體疾病篩查的意義與現狀

妊娠合并遺傳性疾病或出生缺陷的比例約為5%［1］。我國“健康中國2030”規劃中將“減少出生缺陷”列為工作重點內容，而超過80%的出生缺陷疾病是由遺傳因素單獨或協同作用導致的［2］。胎兒染色體非整倍體異常是引起出生缺陷的最主要原因，也是引起新生兒及兒童死亡的主要原因之一［1，3］。目前對此尚缺乏有效的治療手段，且患者預后極差。孕期可通過羊膜腔穿刺、絨毛取材或臍帶血穿刺等有創方式獲得胎兒細胞，進行相關疾病的產前診斷，但這些產前診斷方法均屬于有創性檢查且技術復雜。目前國內外的普遍做法是先通過經濟、簡便、無創的產前篩查手段，篩查出高風險人群，再采用各種產前診斷方法進一步明確診斷。

高齡孕婦、血清學篩查高風險和超聲“軟指標”異常是產前診斷的主要指征，但據此針對胎兒T21的檢出率為60%～80%，陽性預測值約為5%［4-6］，因此無法實現全面預防控制出生缺陷。與傳統產前篩查技術相比，基于cffDNA 檢測的NIPT 技術可明顯提高T21 和T18 的檢出率及陽性預測值，并顯著降低其假陽性率［7］。有文獻報道，采用NIPT 技術進行T21 產前篩查的檢出率約為 99.7%［8］，但對 T18、T13和性染色體非整倍體（sex chromosome aneuploidies，SCA）產前篩查的檢出率均低于T21，分別為98.2%、99.0%和95.8%［8-9］；并且SCA 患者出生時往往無明顯臨床癥狀，短期的新生兒隨訪難以發現SCA，故NIPT對胎兒SCA的檢出率尚需長期隨訪數據支持。即便如此，NIPT技術已明顯提高了胎兒染色體非整倍體疾病的檢出率［4-9］，但其臨床應用仍需規范指導。

2 cffDNA進行染色體非整倍體篩查的基本原理

1997年《Lancet》上首次報道了從孕婦外周血的血漿中發現了cffDNA，其來自于胎兒的DNA 片段，因攜帶了胎兒的遺傳信息，可以用來檢測胎兒的遺傳性疾病，為NIPT 技術的臨床應用開辟了新紀元［10］。機體的造血細胞和體細胞在細胞凋亡的過程中，會產生一些DNA 片段游離于血漿中，即游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）片段，cfDNA 基因組譜可反映個體的染色體情況。在妊娠期間，胎盤滋養層細胞和少數胎兒細胞在細胞凋亡過程中產生的cffDNA 也被釋放到母體血漿中［11］。cffDNA 基因譜亦可反映胎兒的染色體情況，故可以用來檢測胎兒染色體異常［12］。

2011年以來，分子生物學技術快速發展，NGS技術可對母體血漿中的cffDNA 進行精準測序及染色體定位，從而進行胎兒染色體非整倍體的NIPT 檢測。目前，大規模并行測序（massive parallel sequencing，MPS）技術是最常用的全基因組測序方法，也是進行 cffDNA 篩查的主要測序技術［9，13］。部分靶向測序技術也可用于檢測母體血漿中的cffDNA，如單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）測 序［14］和 染 色 體 靶 向 測 序（chromosome-targeted sequencing，CTS）［15］?；诓煌瑴y序技術的NIPT 方案，各有其優劣勢。SNPNIPT和CTS-NIPT方案具有成本低和敏感度穩定等優勢，但僅能獲得目標區域的cffDNA 片段信息［14-15］。與之相比，MPS-NIPT方案可得到全基因組的cffDNA序列信息，除可檢測胎兒整個染色體組非整倍體異常之外，也可檢測由羅氏易位以及染色體微缺失和微重復引起的染色體異常［9，13］。我國各地進行NIPT 檢測主要采用MPS-NIPT 方法，其在北美和亞歐等許多國家亦獲得廣泛的臨床應用［9］。

3 NIPT應用指南

cffDNA用于NIPT檢測以來，國際學術團體相繼發表指導意見和專家共識。2012年，美國婦產科學會 （American College of Obstetricians and Gynecologists，ACOG）發表《胎兒染色體非整倍體的NIPT 檢測》，指出cffDNA 對各染色體篩查的特異度和敏感度存在差異，針對21 號染色體最高，其他染色體略低［16］。2013 年，美國遺傳和基因組學會（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）發表《ACMG 指南：胎兒染色體非整倍體的NIPT 篩查》，自愿檢查、知情決策、專業遺傳咨詢和明確臨床路徑是NIPT應用的基本原則，并建議將其檢測范圍限定于T21、T18和T13，檢測對象限定于胎兒染色體非整倍體高風險孕婦［17］。2015 年ACMG又對指南做了更新，提出在充分告知患者NIPT檢測的檢出率、特異度、陽性預測值和陰性預測值的前提下，一般風險孕婦也可以選擇NIPT檢測［18］。

NIPT 是一種篩查方法，而不是診斷方法。Badeau 等［19］對 NIPT 的產前篩查價值進行薈萃分析顯示，NIPT 用于篩查 T21、T18 和 T13 胎兒的敏感度為95.8%～99.7%，特異度＞99%。我國衛生健康委員會發布的《孕婦外周血胎兒游離DNA產前篩查與診斷技術規范》將NIPT 定位為血清學篩查的補充，若孕婦具有產前診斷指征或者存在影響NIPT 結果的因素，則為cffDNA 篩查的慎用人群或不適用人群，但工作中仍需根據不同孕婦的實際情況個體化選擇產前篩查和產前診斷方案。

4 影響NIPT檢測結果的因素

4.1 母體因素 由于NIPT 技術需要檢測孕婦血漿中的cffDNA片段，若母血中cffDNA含量低于4%，可導致NIPT 檢測失敗。據文獻報道，NIPT 檢測失敗率約為0.3%［20］。母體的一些疾病狀態可以增加母體細胞凋亡，但是胎盤細胞凋亡并不隨之增加，在孕婦血漿中這些細胞代謝產生的cfDNA，來自母體的cfDNA 比例增加，而cffDNA 比例相對減少，可導致NIPT檢測失?。?1］。有研究表明，肥胖孕婦尤其是體質量指數（BMI）＞35 kg/m2的孕婦，血漿中cfDNA 來自母體的比例明顯增加，其原因可能與脂肪細胞壞死、凋亡增加有關；而cffDNA片段相對不足，可導致NIPT 檢測失敗，失敗率約為2.2%［21-22］。另外，活動性自身免疫性疾病也可以加快細胞代謝，使母體產生的cfDNA增加。有學者通過MPS和甲基化測序技術對系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者血漿DNA 片段的生物學特性進行分析發現，SLE 患者血漿中cfDNA 含量明顯增加且表達譜系異常［23］。SLE孕婦血漿中來自母體的cfDNA比例增加，則cffDNA 片段相對不足，導致NIPT 檢測失??；而cfDNA表達譜系異常亦可引起NIPT的假陽性結果［22-24］。此外，孕期藥物攝入也可影響血漿中cfDNA 的含量，例如孕期注射低分子肝素可使cfDNA 含量明顯增加［25］；孕婦服用降壓藥或抗生素等藥物可使cffDNA 低于4%的比例明顯增加，導致NIPT 檢測失?。?6］。另有研究顯示，吸煙、妊娠期合并高血壓、惡性腫瘤等因素均可導致NIPT 檢測失?。?2，27］。

孕婦患有淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病和結直腸癌等惡性腫瘤可導致NIPT 檢測出現假陽性結果［24，27-29］。2013 年 Osborne 等［24］首次報道了母體惡性腫瘤可以導致NIPT的假陽性結果，分析其原因是腫瘤細胞基因組中DNA 片段存在多個重復和缺失區域，使得患者和參考DNA之間的預期比率發生偏差，導致檢測失敗或異常的多個染色體非整倍體。有文獻報道在39 例NIPT 結果提示多條染色體非整倍體異常病例中，7 例可歸因于母體的無癥狀惡性腫瘤［27］。因此，孕婦進行 cffDNA 的 NIPT 檢測前應注意母體惡性腫瘤的影響。也有學者據此提出，可以評估cfDNA 作為癌癥早期生物標志物的潛力［27-29］。另外，孕婦染色體異常（主要為性染色體結構或數目異常）、染色體嵌合異常、染色體拷貝數變異均可引起NIPT的假陽性結果。此外，對于存在器官移植或異體輸血史的孕婦，若其引入的外源細胞為染色體非整倍體，其代謝產生的cfDNA 片段釋放入血漿中，亦可導致NIPT的假陽性結果［22，27］。

4.2 胎兒因素 有文獻報道，雙胎妊娠可通過NIPT進行胎兒染色體非整倍體篩查，尤其是針對T21 的篩查，但由于NIPT 檢測的cffDNA 主要來源于胎盤組織，雙胎的絨毛膜性可能影響NIPT 的檢測結果［30-31］。對于雙絨毛膜雙胎來說，NIPT 檢測可按照2 個胎兒處理；對于單絨毛膜雙胎來說，若2 個胎兒遺傳物質相同，可按單胎處理［30］；若2個胎兒遺傳物質不同，需按照2個胎兒處理，胎盤與胎兒之間染色體情況差異可能會造成NIPT 檢測的假陰性結果［30-31］。若雙胎其中之一因染色體非整倍體而發生胎停育可導致NIPT的假陽性結果，其原因可能是發生胎停育的一胎仍可不斷向母體血漿中釋放DNA片段，其影響可持續7～8 周，一般不超過12～14周［32］。尹愛華教授團隊通過對432 例雙胎的NIPT結果進行分析發現，NIPT用于雙胎妊娠胎兒染色體非整倍體篩查的敏感度和特異度分別為100%和99.53%［33］。但是，NIPT在雙胎中的應用尚缺少大樣本的臨床數據，因此對雙胎妊娠胎兒染色體非整倍體的篩查價值尚需大樣本臨床研究驗證。

局限性胎盤嵌合（confined placental mosaicism，CPM）是引起NIPT結果與胎兒染色體核型不一致的最常見原因［34］。染色體嵌合是指在一個個體內發現2個及以上具有不同染色體核型的細胞系。嵌合現象可以在所有組織中發生，也可局限于特定組織。在妊娠期間，異常細胞系可能局限于胎盤，即CPM［35］。在NIPT檢測時，CPM會干擾其結果的準確性。如果異常細胞系存在于胎盤，而正常二倍體細胞系存在于胎兒組織，可造成NIPT 的假陽性結果；反之，如果正常二倍體細胞系局限于胎盤，而胎兒存在T21、T18和T13，則可造成NIPT的假陰性結果［36］。Kypri 等［37］的前瞻性研究顯示，NIPT 檢測T21、T18、T13 和SCA 的陽性預測值分別為100%、100%、71%和57%，與CPM 發生率呈負相關，這也是進行NIPT檢測T13和SCA假陽性率較高的原因之一。

綜上所述，通過檢測孕婦血漿中cffDNA 進行NIPT對篩查胎兒染色體非整倍體異常（尤其是T21）具有較好的臨床價值和應用前景，但孕婦的疾病狀態及孕期用藥情況、雙胎妊娠或妊娠過程中CPM的發生均會影響NIPT的檢測結果，因此臨床應用時需要注意。