蔗田污染物過硫酸銨和甲胺磷的快速精準檢測方法探討

趙歡歡，付建濤，毛玉玲，黃衛娟*

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2廣東省藥肥工程技術研究中心，廣東廣州510316)

0 引言

甘蔗是廣西、云南等地區的主要經濟作物之一，是當地經濟發展的重要支柱和蔗農的主要經濟來源，而蔗田農藥殘留和土壤重金屬污染是制約甘蔗產業發展的重要因素。甘蔗生長過程中深受病蟲草害影響，目前防治病蟲草害多使用化學藥劑，且多數化學藥劑有一定的生物蓄積作用，對哺乳動物、鳥類及水生無脊椎動物有毒性作用。農藥化肥污染已成為土壤污染中面積最大、危害最大的環境污染之一，受到了社會的廣泛關注。

積極尋找蔗田農藥、化肥殘留污染的有效快速檢測手段顯得尤為重要。目前，土壤污染物檢測方法雖然較多，包括光學檢測方法、電化學檢測法、生物學相關檢測法以及氣相、液相色譜法等[1]。然而現有的檢測儀器報價昂貴、樣品預處理程序復雜，不僅耗時費力耗錢，也限制了在基層農業企業中的使用。

近年來，國內學者采用微核技術檢測具有誘變性的污水、化學藥品、農藥等。蠶豆(Vicia f aba)作為一種理想的細胞遺傳學研究材料。蠶豆的染色體大，數量少(2n=12)，根尖中含有較多的分裂相細胞，非常適合顯微觀察，而且蠶豆根尖細胞周期中的大部分時間對誘變劑敏感，便于遺傳毒性檢測實驗[2]。相較之下，甘蔗根系生長緩慢，實驗周期長，且為多倍體，染色體數量因品種不同而差異較大，用甘蔗自身材料來檢測蔗田污染物的效果預見性不夠強，不如蠶豆根尖的檢測靈敏度高。

早在1959年，放射生物學家已經用蠶豆的根尖細胞來進行X射線的遺傳損傷研究[2]。到了70年代，蠶豆根尖染色體畸變技術已發展得相當成熟，作為一種檢測化學品遺傳學毒性的方法為人們所知[3]。蠶豆根尖微(Micronucleus，MCN)技術[4]不僅具有簡便、快捷、重復性好和靈敏度高的優勢，而且其檢測結果與動物試驗結果具有很高的一致性[5]。因此，1986年蠶豆根尖微核試驗被我國環保局列為水環境生物測試的規范方法，用于檢測水體的致突變性[6]。

用微核來評價污染物、有毒物質、藥物對體外培養細胞遺傳學損傷仍是一個直觀可行的方法[7-8]。然而，對農田土壤污染物的檢測雖有研究報道，但仍需要更多的普及應用。本文采用蠶豆根尖微核試驗對蔗田污染物包括過硫酸銨以及農藥甲胺磷的誘變能力進行檢測，分別研究兩者對蠶豆根尖細胞的誘變能力，以期為檢測蔗田污染物提供參考，為農業生產上安全合理使用農藥和污染治理提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料的來源和培養

實驗用的蠶豆種子來源于蕪湖種子市場，實驗室內溫度為(10±5)℃，自然光照條件下培養24 h后，再置于恒溫箱內培養24 h，使用蒸餾水培養。

1.2 實驗用具和儀器準備

實驗使用的儀器用具有：燒杯、EP管、玻璃棒、量筒、移液管、蓋玻片、載玻片、鑷子、剪刀、膠頭滴管、白瓷盤、紗布、水浴鍋、恒溫箱、顯微鏡等。

1.3 實驗設計和操作步驟

1.3.1 浸種、催芽

選取籽粒飽滿、大小一致的蠶豆種子洗凈后，放入盛有蒸餾水的燒杯中，25℃下浸泡24 h，期間換水2次。待種子吸脹后，放入用蒸餾水浸濕紗布鋪墊的白瓷盤中水培24 h，于室溫下催芽48 h再移至恒溫箱中培養24 h，至初生根長至2 cm左右。

1.3.2 染毒

用蒸餾水將過硫酸銨配制成8種不同濃度，分別是 10000、5000、1000、500、100、10、1、0.1 mg/L。對農藥甲胺磷用蒸餾水稀釋配置成6種濃度，分別是 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3 g/L。另設蒸餾水做對照。選取發育良好，根的長度約為1～2 cm的蠶豆幼苗，將幼苗分別放入裝有不同濃度甲胺磷和過硫酸銨溶液的EP管中并對各管做標記，染毒處理24 h。同時用蒸餾水設立空白對照組。

1.3.3 固定、保存

切下0.5～1 cm長的乳白色幼根放入對應編號的試管，向各試管中加入新配制的卡諾氏固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h。然后用蒸餾水清洗根尖后，再放入70%酒精中保存備用(保存時間不超過2 個月)。

1.3.4 解離

從固定液中取出蠶豆根尖，用蒸餾水漂洗，再放到0.1 mol/L HCl中，在60℃水浴中處理8 min，使根尖軟化。

1.3.5 染色和壓片

取處理好的根尖用蒸餾水漂洗數次后，置于載玻片上，用吸水紙吸去多余的液體，用刀片將根尖的分生組織切下并切碎，加1～2滴改良的堿性品紅染色5 min，進行常規壓片。

1.3.6 鏡檢

每組各取3～5個根尖在高倍鏡下觀察，每個根尖至少觀察500～1000個細胞，并記錄發生微核的細胞數。

1.4 統計參數[9]

微核千分率 MCN‰=(出現微核的細胞數/計數的細胞總數)×1000‰。數據采用SPSS軟件進行統計分析并作圖。

1.5 微核計數標準[10]

微核染色體的結構和顏色深淺同主核相似。轉動微調時，與主核處于同一水平面；圓形或卵圓形，界限清楚，包含于胞漿中，直徑小于主核的1/3，并與主核不相連；微核完整，不重疊，但死亡或降解的細胞除外。

2 結果與分析

2.1 過硫酸銨處理對MCN‰的影響

蠶豆根尖各個處理的微核千分率(MCN‰)見表1。通過表中數據發現，過硫酸銨濃度在100～1000 mg/L時，不同處理組之間的微核千分率(MCN‰)有著顯著差異(P＜0.05)；過硫酸銨濃度在 100～5000 mg/L時，不同處理組與對照組相比有著顯著差異(P＜0.05)，而當過硫酸銨濃度達到10000 mg/L，則與對照組無顯著差異。從表1和圖1中也可以看出，隨著過硫酸銨濃度從0增加至500 mg/L時，MCN‰也在上升，表明過硫酸銨對蠶豆根尖細胞的毒害作用增強；但是，當濃度從500 mg/L增加到1000 mg/L時，MCN‰則開始下降，降低為10.69‰，隨著濃度進一步增加至10000 mg/L時，MCN‰減少至僅為4.78‰。

除此以外，研究發現在出現微核的細胞中，微核的數量也是不同的，有1～2個，甚至有的細胞有多個微核出現。在對照組中常不超過5個微核，而處理組細胞中微核多在10個以上，說明低濃度過硫酸銨對蠶豆根尖細胞足以產生較強的誘變性和毒性。同時發現蠶豆根尖細胞有絲分裂受到不同程度的阻礙，表明在低濃度下過硫酸銨已經對蠶豆根尖細胞的生長造成了損害。

2.2 過硫酸銨處理蠶豆根尖細胞后的微核現象

表1 染毒24 h后不同濃度過硫酸銨對蠶豆根尖微核千分率(MCN‰)的影響

過硫酸銨處理蠶豆根尖細胞可誘導產生微核，細胞內出現單微核、雙微核以及三微核等，且在蠶豆根尖細胞有絲分裂各時相中均能觀察到微核。在10～1000 mg/L濃度范圍內設定幾個濃度梯度，利用微核檢測進一步檢驗此濃度范圍內過硫酸銨對蠶豆根尖的誘變影響的具體變化，發現500 mg/L過硫酸銨濃度影響下，微核總數達到最高值，為過硫酸銨對蠶豆根尖的最佳誘變濃度(圖1)。同時，經高濃度過硫酸銨(≥100 mg/L)的誘變，顯微鏡下還能明顯觀察到染色體畸變，如染色體丟失、染色體斷片、染色體滯后等現象，說明過硫酸銨處理對蠶豆根尖細胞遺傳物質造成不同程度的損傷。

圖1 不同濃度過硫酸銨對蠶豆根尖細胞的影響

2.3 蔗田農藥污染物甲胺磷對蠶豆根尖細胞微核的誘變效應

已有較多研究報道了農田殺蟲劑、除草劑等農藥對蠶豆根尖細胞有較強的遺傳毒性。本文以防治甘蔗綿蚜常用的甲胺磷為研究對象，基于蠶豆根尖微核試驗的測定手段，判斷其對植物細胞誘變的遺傳毒性。從圖2可以看出，隨著處理液濃度的增加，蠶豆根尖細胞MCN‰逐步上升，尤其濃度大于0.2 g/L之后，根尖微核率快速增加，誘變作用也迅速增強。進而表明高濃度的農藥有很強的誘變效應，濃度越高，毒性越大，造成的遺傳損傷也越嚴重。

3 討論

圖2 甲胺磷對蠶豆根尖細胞微核的誘變效應

本實驗結果表明高濃度的過硫酸銨和甲胺磷對蠶豆根尖具有較高的誘變性能，其遺傳毒害可在細胞分裂期間DNA和染色體的復制合成過程中產生，并以微核形式顯示[11]。各實驗處理組和對照組的比較則表明高濃度的過硫酸銨和甲胺磷會嚴重阻礙根尖細胞分裂，其MCN‰和對照組差異不顯著，而能保證細胞具有一定程度分裂水平的處理組和對照組則差異顯著。

甘蔗生長周期長，易受到多種病、蟲、草、鼠等有害生物的為害等特點。除了本研究的兩種污染物之外，甘蔗生產上長期使用高毒農藥、化學肥料和除草劑等，包括呋喃丹、甲拌磷、特丁硫磷、甲基異柳磷、莠去津、乙草胺、二甲吩草胺等[12-13]，造成土壤環境的污染，仍缺乏快速便捷的檢測方法，有待微核檢測技術的應用。

由于環境污染會引起植物細胞內染色體畸變而形成微核，相對于蠶豆，甘蔗生根較慢，且對蔗田污染物具有一定的耐受性，不宜作為細胞微核檢測的優良材料。而蠶豆根尖生長迅速，對環境誘變劑敏感度較高，且染色體數量相對甘蔗較少，易于染色顯微觀察，為蔗區污染物提供了新的檢測技術參考。因此，通過蠶豆細胞微核的致畸程度，預測蔗田污染物對甘蔗生長的危害具有一定的參考意義。