蔗田污染物過硫酸銨和甲胺磷的快速精準(zhǔn)檢測方法探討

趙歡歡，付建濤，毛玉玲，黃衛(wèi)娟*

(1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室，廣東廣州510316；2廣東省藥肥工程技術(shù)研究中心，廣東廣州510316)

0 引言

甘蔗是廣西、云南等地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一，是當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱和蔗農(nóng)的主要經(jīng)濟(jì)來源，而蔗田農(nóng)藥殘留和土壤重金屬污染是制約甘蔗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。甘蔗生長過程中深受病蟲草害影響，目前防治病蟲草害多使用化學(xué)藥劑，且多數(shù)化學(xué)藥劑有一定的生物蓄積作用，對哺乳動物、鳥類及水生無脊椎動物有毒性作用。農(nóng)藥化肥污染已成為土壤污染中面積最大、危害最大的環(huán)境污染之一，受到了社會的廣泛關(guān)注。

積極尋找蔗田農(nóng)藥、化肥殘留污染的有效快速檢測手段顯得尤為重要。目前，土壤污染物檢測方法雖然較多，包括光學(xué)檢測方法、電化學(xué)檢測法、生物學(xué)相關(guān)檢測法以及氣相、液相色譜法等[1]。然而現(xiàn)有的檢測儀器報價昂貴、樣品預(yù)處理程序復(fù)雜，不僅耗時費力耗錢，也限制了在基層農(nóng)業(yè)企業(yè)中的使用。

近年來，國內(nèi)學(xué)者采用微核技術(shù)檢測具有誘變性的污水、化學(xué)藥品、農(nóng)藥等。蠶豆(Vicia f aba)作為一種理想的細(xì)胞遺傳學(xué)研究材料。蠶豆的染色體大，數(shù)量少(2n=12)，根尖中含有較多的分裂相細(xì)胞，非常適合顯微觀察，而且蠶豆根尖細(xì)胞周期中的大部分時間對誘變劑敏感，便于遺傳毒性檢測實驗[2]。相較之下，甘蔗根系生長緩慢，實驗周期長，且為多倍體，染色體數(shù)量因品種不同而差異較大，用甘蔗自身材料來檢測蔗田污染物的效果預(yù)見性不夠強(qiáng)，不如蠶豆根尖的檢測靈敏度高。

早在1959年，放射生物學(xué)家已經(jīng)用蠶豆的根尖細(xì)胞來進(jìn)行X射線的遺傳損傷研究[2]。到了70年代，蠶豆根尖染色體畸變技術(shù)已發(fā)展得相當(dāng)成熟，作為一種檢測化學(xué)品遺傳學(xué)毒性的方法為人們所知[3]。蠶豆根尖微(Micronucleus，MCN)技術(shù)[4]不僅具有簡便、快捷、重復(fù)性好和靈敏度高的優(yōu)勢，而且其檢測結(jié)果與動物試驗結(jié)果具有很高的一致性[5]。因此，1986年蠶豆根尖微核試驗被我國環(huán)保局列為水環(huán)境生物測試的規(guī)范方法，用于檢測水體的致突變性[6]。

用微核來評價污染物、有毒物質(zhì)、藥物對體外培養(yǎng)細(xì)胞遺傳學(xué)損傷仍是一個直觀可行的方法[7-8]。然而，對農(nóng)田土壤污染物的檢測雖有研究報道，但仍需要更多的普及應(yīng)用。本文采用蠶豆根尖微核試驗對蔗田污染物包括過硫酸銨以及農(nóng)藥甲胺磷的誘變能力進(jìn)行檢測，分別研究兩者對蠶豆根尖細(xì)胞的誘變能力，以期為檢測蔗田污染物提供參考，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上安全合理使用農(nóng)藥和污染治理提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料的來源和培養(yǎng)

實驗用的蠶豆種子來源于蕪湖種子市場，實驗室內(nèi)溫度為(10±5)℃，自然光照條件下培養(yǎng)24 h后，再置于恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，使用蒸餾水培養(yǎng)。

1.2 實驗用具和儀器準(zhǔn)備

實驗使用的儀器用具有：燒杯、EP管、玻璃棒、量筒、移液管、蓋玻片、載玻片、鑷子、剪刀、膠頭滴管、白瓷盤、紗布、水浴鍋、恒溫箱、顯微鏡等。

1.3 實驗設(shè)計和操作步驟

1.3.1 浸種、催芽

選取籽粒飽滿、大小一致的蠶豆種子洗凈后，放入盛有蒸餾水的燒杯中，25℃下浸泡24 h，期間換水2次。待種子吸脹后，放入用蒸餾水浸濕紗布鋪墊的白瓷盤中水培24 h，于室溫下催芽48 h再移至恒溫箱中培養(yǎng)24 h，至初生根長至2 cm左右。

1.3.2 染毒

用蒸餾水將過硫酸銨配制成8種不同濃度，分別是 10000、5000、1000、500、100、10、1、0.1 mg/L。對農(nóng)藥甲胺磷用蒸餾水稀釋配置成6種濃度，分別是 0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.3 g/L。另設(shè)蒸餾水做對照。選取發(fā)育良好，根的長度約為1～2 cm的蠶豆幼苗，將幼苗分別放入裝有不同濃度甲胺磷和過硫酸銨溶液的EP管中并對各管做標(biāo)記，染毒處理24 h。同時用蒸餾水設(shè)立空白對照組。

1.3.3 固定、保存

切下0.5～1 cm長的乳白色幼根放入對應(yīng)編號的試管，向各試管中加入新配制的卡諾氏固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定24 h。然后用蒸餾水清洗根尖后，再放入70%酒精中保存?zhèn)溆?保存時間不超過2 個月)。

1.3.4 解離

從固定液中取出蠶豆根尖，用蒸餾水漂洗，再放到0.1 mol/L HCl中，在60℃水浴中處理8 min，使根尖軟化。

1.3.5 染色和壓片

取處理好的根尖用蒸餾水漂洗數(shù)次后，置于載玻片上，用吸水紙吸去多余的液體，用刀片將根尖的分生組織切下并切碎，加1～2滴改良的堿性品紅染色5 min，進(jìn)行常規(guī)壓片。

1.3.6 鏡檢

每組各取3～5個根尖在高倍鏡下觀察，每個根尖至少觀察500～1000個細(xì)胞，并記錄發(fā)生微核的細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計參數(shù)[9]

微核千分率 MCN‰=(出現(xiàn)微核的細(xì)胞數(shù)/計數(shù)的細(xì)胞總數(shù))×1000‰。數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析并作圖。

1.5 微核計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)[10]

微核染色體的結(jié)構(gòu)和顏色深淺同主核相似。轉(zhuǎn)動微調(diào)時，與主核處于同一水平面；圓形或卵圓形，界限清楚，包含于胞漿中，直徑小于主核的1/3，并與主核不相連；微核完整，不重疊，但死亡或降解的細(xì)胞除外。

2 結(jié)果與分析

2.1 過硫酸銨處理對MCN‰的影響

蠶豆根尖各個處理的微核千分率(MCN‰)見表1。通過表中數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，過硫酸銨濃度在100～1000 mg/L時，不同處理組之間的微核千分率(MCN‰)有著顯著差異(P＜0.05)；過硫酸銨濃度在 100～5000 mg/L時，不同處理組與對照組相比有著顯著差異(P＜0.05)，而當(dāng)過硫酸銨濃度達(dá)到10000 mg/L，則與對照組無顯著差異。從表1和圖1中也可以看出，隨著過硫酸銨濃度從0增加至500 mg/L時，MCN‰也在上升，表明過硫酸銨對蠶豆根尖細(xì)胞的毒害作用增強(qiáng)；但是，當(dāng)濃度從500 mg/L增加到1000 mg/L時，MCN‰則開始下降，降低為10.69‰，隨著濃度進(jìn)一步增加至10000 mg/L時，MCN‰減少至僅為4.78‰。

除此以外，研究發(fā)現(xiàn)在出現(xiàn)微核的細(xì)胞中，微核的數(shù)量也是不同的，有1～2個，甚至有的細(xì)胞有多個微核出現(xiàn)。在對照組中常不超過5個微核，而處理組細(xì)胞中微核多在10個以上，說明低濃度過硫酸銨對蠶豆根尖細(xì)胞足以產(chǎn)生較強(qiáng)的誘變性和毒性。同時發(fā)現(xiàn)蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂受到不同程度的阻礙，表明在低濃度下過硫酸銨已經(jīng)對蠶豆根尖細(xì)胞的生長造成了損害。

2.2 過硫酸銨處理蠶豆根尖細(xì)胞后的微核現(xiàn)象

表1 染毒24 h后不同濃度過硫酸銨對蠶豆根尖微核千分率(MCN‰)的影響

過硫酸銨處理蠶豆根尖細(xì)胞可誘導(dǎo)產(chǎn)生微核，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)單微核、雙微核以及三微核等，且在蠶豆根尖細(xì)胞有絲分裂各時相中均能觀察到微核。在10～1000 mg/L濃度范圍內(nèi)設(shè)定幾個濃度梯度，利用微核檢測進(jìn)一步檢驗此濃度范圍內(nèi)過硫酸銨對蠶豆根尖的誘變影響的具體變化，發(fā)現(xiàn)500 mg/L過硫酸銨濃度影響下，微核總數(shù)達(dá)到最高值，為過硫酸銨對蠶豆根尖的最佳誘變濃度(圖1)。同時，經(jīng)高濃度過硫酸銨(≥100 mg/L)的誘變，顯微鏡下還能明顯觀察到染色體畸變，如染色體丟失、染色體斷片、染色體滯后等現(xiàn)象，說明過硫酸銨處理對蠶豆根尖細(xì)胞遺傳物質(zhì)造成不同程度的損傷。

圖1 不同濃度過硫酸銨對蠶豆根尖細(xì)胞的影響

2.3 蔗田農(nóng)藥污染物甲胺磷對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘變效應(yīng)

已有較多研究報道了農(nóng)田殺蟲劑、除草劑等農(nóng)藥對蠶豆根尖細(xì)胞有較強(qiáng)的遺傳毒性。本文以防治甘蔗綿蚜常用的甲胺磷為研究對象，基于蠶豆根尖微核試驗的測定手段，判斷其對植物細(xì)胞誘變的遺傳毒性。從圖2可以看出，隨著處理液濃度的增加，蠶豆根尖細(xì)胞MCN‰逐步上升，尤其濃度大于0.2 g/L之后，根尖微核率快速增加，誘變作用也迅速增強(qiáng)。進(jìn)而表明高濃度的農(nóng)藥有很強(qiáng)的誘變效應(yīng)，濃度越高，毒性越大，造成的遺傳損傷也越嚴(yán)重。

3 討論

圖2 甲胺磷對蠶豆根尖細(xì)胞微核的誘變效應(yīng)

本實驗結(jié)果表明高濃度的過硫酸銨和甲胺磷對蠶豆根尖具有較高的誘變性能，其遺傳毒害可在細(xì)胞分裂期間DNA和染色體的復(fù)制合成過程中產(chǎn)生，并以微核形式顯示[11]。各實驗處理組和對照組的比較則表明高濃度的過硫酸銨和甲胺磷會嚴(yán)重阻礙根尖細(xì)胞分裂，其MCN‰和對照組差異不顯著，而能保證細(xì)胞具有一定程度分裂水平的處理組和對照組則差異顯著。

甘蔗生長周期長，易受到多種病、蟲、草、鼠等有害生物的為害等特點。除了本研究的兩種污染物之外，甘蔗生產(chǎn)上長期使用高毒農(nóng)藥、化學(xué)肥料和除草劑等，包括呋喃丹、甲拌磷、特丁硫磷、甲基異柳磷、莠去津、乙草胺、二甲吩草胺等[12-13]，造成土壤環(huán)境的污染，仍缺乏快速便捷的檢測方法，有待微核檢測技術(shù)的應(yīng)用。

由于環(huán)境污染會引起植物細(xì)胞內(nèi)染色體畸變而形成微核，相對于蠶豆，甘蔗生根較慢，且對蔗田污染物具有一定的耐受性，不宜作為細(xì)胞微核檢測的優(yōu)良材料。而蠶豆根尖生長迅速，對環(huán)境誘變劑敏感度較高，且染色體數(shù)量相對甘蔗較少，易于染色顯微觀察，為蔗區(qū)污染物提供了新的檢測技術(shù)參考。因此，通過蠶豆細(xì)胞微核的致畸程度，預(yù)測蔗田污染物對甘蔗生長的危害具有一定的參考意義。