NaOH預處理對甘蔗渣成分和酶解效率的影響

劉 洋，胡小文，姚艷麗

(1中國熱帶農業科學院湛江實驗站，廣東湛江524013；2廣東省旱作節水農業工程技術研究中心，廣東湛江524013)

0 引言

隨著不可再生能源如石油、天然氣、煤炭等的日益枯竭，尋找新的可再生能源將是未來能源化利用的重要方向[1]。可再生能源主要包括太陽能、風力、潮汐能、地熱能、生物質能等[2]。地球上存在著大量的生物質資源，就木質纖維素來說，全球每年由光合作用產生的木質纖維原料高達4500億t[3]，如果將這些生物質資源轉化成燃料乙醇，不僅可以解決部分能源短缺問題，還可以減少污染。目前可供利用的生物質資源主要是作物秸稈，包括玉米、小麥、水稻等秸稈，但是其在收集和搬運過程中耗費成本較高，就目前技術而言還未形成真正的產業化生產。甘蔗是中國最大的制糖原料，南方蔗區甘蔗總產量7000多萬t，每年產生的甘蔗渣產量約為2000多萬t[4]。甘蔗渣是甘蔗榨糖后的產物，利用其生產燃料乙醇不僅可以實現廢棄物的再利用，更極大地避免了因直接燃燒而帶來的環境污染問題，同時甘蔗渣收集簡單，成本較低，因此利用甘蔗渣生產燃料乙醇具有廣闊的發展前景[5]。

和其他生物質原料一樣，甘蔗渣成分主要包括木質素、纖維素、半纖維素、灰分等，由于甘蔗渣原料的組成及結構特點，木質素和纖維素、半纖維素纏繞在一起形成晶體結構，阻礙了纖維素酶與底物的接觸，大大降低了酶解效果[6]，因此必須采取預處理手段才能打破原有的晶體結構提高其酶解能力。現有的預處理技術主要有物理法、化學法、生物法等[7]，其中堿處理可以在低溫條件下進行，不僅纖維素和半纖維素損失少，而且無抑制產物形成，受到了廣泛關注[8]。在堿性環境下，半纖維素及木質素分子間的酯鍵發生皂化，酯鍵的斷裂引起木質素溶解，同時纖維素、半纖維素和木質素間的孔隙增大，造成纖維素溶脹和結晶度降低等[9]，因此NaOH可以有效地去除木質素，使纖維素潤脹，有利于提高酶解效率[10]。前人的研究發現，預處理溫度、NaOH質量分數及預處理時間對酶解和發酵效率影響較為顯著，經過NaOH預處理后的甘蔗渣比表面積顯著增加，木質素顯著降低[11]。在低濃度的NaOH溶液范圍內，甘蔗渣的結晶度值升高，當NaOH溶液濃度再升高時，甘蔗渣纖維素的結晶度值下降[12]。研究還發現，NaOH預處理可以有效提高甘蔗渣的酶解效率，促進低聚木糖的生產[13]。雖然前人在NaOH預處理甘蔗渣做了一些研究，但是仍有一些問題需要進一步研究和改進。一是在不同的NaOH濃度、溫度、處理時間和固液比條件下，甘蔗渣成分和物理結構如何變化；二是預處理條件是否可以更加優化。針對這2個問題，本文在前人研究的基礎上，系統分析不同NaOH預處理條件對甘蔗渣成分、固體得率、物理結構和酶解效率的影響，期望能為今后開展甘蔗渣乙醇生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甘蔗渣來自湛江大華甘蔗制糖企業，在中國熱帶農業科學院湛江實驗站實驗室保存。

1.2 實驗試劑

纖維素酶購買自Solarbio公司，檸檬酸、檸檬酸鈉、3, 5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚和無水亞硫酸氫鉀購買自上海麥克林公司，所用試劑均為分析純。

1.3 實驗儀器

FW100泰斯特粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-75KBS申安高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；723PCS鳳凰紫外可見分光光度計，上海鳳凰光學科儀有限公司；SHZ-DIII予華牌循環水真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；DHG-9123A鼓風干燥箱，上海一恒科學儀器有限公司；HH-6金壇華立恒溫水浴鍋，金壇市華立實驗儀器廠；RU-T-15超純水系統，上海同田儀器有限公司；THZ-82國立恒溫氣浴搖床，常州市國立試驗設備研究所；JA3003N電子天秤，上海菁海儀器有限公司；DS3200普洛帝超聲波振蕩器，陜西普洛帝測控技術有限公司；JY100喬躍雪花制冰機，上海喬躍電子有限公司；H1850R湘儀冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；S-3700N掃描電子顯微鏡，日本HITACHI公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 NaOH濃度的實驗方法

在100 mL三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分別加入濃度為7%、9%、10%、11%、13%的NaOH溶液，使固體和液體充分混勻后在水浴鍋內50℃下反應30 min，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，備用。

1.4.2 處理溫度的實驗方法

在100 mL三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分別加入濃度為9%的NaOH溶液，使固體和液體充分混勻后分別在水浴鍋內30、40、50、60、70℃下反應30 min，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，備用。

1.4.3 固液比的實驗方法

在100 mL三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按固液比1︰8、1︰10、1︰12、1︰14、1︰16(g/mL)分別加入濃度為 9%的NaOH溶液，使固體和液體充分混勻后在水浴鍋內50℃下反應30 min，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，備用。

1.4.4 處理時間的實驗方法

在100 mL三角瓶中加入粒徑0.425～0.850 mm的甘蔗渣粉末2.0 g，然后按1︰10(g/mL)的固液比分別加入濃度為9%的NaOH溶液，使固體和液體充分混勻后在水浴鍋內50℃下分別反應10、20、30、40、50 min，冷卻，用蒸餾水洗滌至中性，抽濾，備用。

1.4.5 甘蔗渣成分的測定

甘蔗渣成分分析甘蔗渣中半纖維素、纖維素和木質素含量測定參考國際生物能源中心提供的方法《Determination of Structural Carbohydrates and Lignin in Biomass》[14]，木質素的測定參考國標GB/T 747-2003[15]。

1.4.6 固體得率的測定

試樣經NaOH處理后固體部分用蒸餾水沖洗至中性，用G3號砂芯漏斗抽濾，于105℃烘箱烘至恒重，計算其固體得率。

固體得率(%)=(處理后樣品重/處理前樣品重)×100%。

1.4.7 掃描電鏡實驗方法

對處理前后的甘蔗渣樣品進行鍍金處理，然后利用掃描電子顯微鏡觀察樣品的物理表面特征和內部結構特征，選擇聚焦距離為10 μm和50 μm拍照記錄并保存。

1.4.8 纖維素酶液的制備

稱取商品干粉纖維素酶(3 units/mg)1.650 g，用檸檬酸緩沖溶液配制100 mL酶液。配制檸檬酸鈉緩沖液0.05 mol/L pH 4.8，所用的檸檬酸、檸檬酸鈉試劑均為分析純。配制方法如下：首先分別配制A、B液，然后按一定比例混合。A液(檸檬酸溶液 0.1 mol/L)：精確稱取C6H8O7(MW=210.14)試劑21.014 g置于250 mL燒杯中，加入適量蒸餾水攪拌溶解，轉移至1000 mL容量瓶并多次漂洗，用蒸餾水定容后混勻，放入4℃冰箱保存備用。B液(檸檬酸鈉溶液0.1 mol/L)：精確稱取 Na3C6H5O7·2H2O(MW=294.12)試劑29.412 g置于250 mL燒杯中，加入適量蒸餾水攪拌溶解，轉移至1000 mL容量瓶并多次漂洗，用蒸餾水定容后混勻，同樣放入4℃冰箱中保存備用。量取A液27.12 mL和B液22.88 mL使其充分混合，移入 100 mL容量瓶定容至刻度，充分混勻，得到0.05 mol/L pH 4.8的檸檬酸緩沖液，于4℃冰箱中保存，用于測定濾紙酶活。

1.4.9 酶活性測定

酶解反應在100 mL三角瓶中進行，取預處理后絕干重為1 g的甘蔗渣作為酶解底物，以固液比1︰16，加入 pH為 4.8的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，纖維素酶用量為20 FPU/g(絕干底物)，在50℃，100 r/min的恒溫振蕩器中反應48 h。酶解完成后，沸水浴10 min終止酶解反應，冰水冷卻，于12000 r/min離心5 min，取上清液稀釋適當倍數測還原糖和糠醛含量，過濾并洗滌酶解固體，風干后保存于密封袋，用于后續檢測。測定纖維素酶酶活以FPU/mL表示，定義為：在 50℃條件下 60 min內分解濾紙產生 1 μmol葡萄糖為1個活力單位。酶活測定依照美國可再生能源實驗室出版的方法《Measurement of Cellulase Activities》[16]。β-葡萄糖苷酶酶活單位(U/mL)定義為：在測定條件(pH值5.0，50℃±2℃)下，每分鐘水解底物產生1 μmol對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活單位。酶活測定方法參考韋斌如建立的 pNPG比色法[17]。還原糖濃度測定采用 DNS法(3, 5-二硝基水楊酸法)[18]。

2 結果與分析

2.1 不同堿處理對甘蔗渣主要成分的影響

圖1實驗結果表明，不同堿濃度對半纖維素和纖維素影響較大，隨著堿濃度的增加，半纖維素和纖維素含量逐漸降低，在堿濃度為7%時，半纖維素含量和纖維素含量均最高，分別為 16.85%和45.63%；在堿濃度為13%時，半纖維素含量和纖維素含量均最低，分別為9.87%和37.56%。木質素含量也隨著堿濃度的增大而逐漸降低，但變化相對較小，變化范圍為15.23%～17.85%(圖1)。

不同處理溫度對半纖維素影響最大，當溫度上升到50℃以上時，半纖維素含量迅速下降，在溫度為70℃時，半纖維素含量最低，為8.25%。纖維素含量隨著溫度的上升呈現逐漸下降的趨勢，在溫度為70℃時，纖維素含量最低，為35.65%。木質素含量雖然隨著溫度的升高呈現一定的下降趨勢，但變化不是十分明顯，變化范圍15.98%～18.55%(圖2)。

圖1 不同堿濃度對甘蔗渣成分的影響

圖2 不同堿處理溫度對甘蔗渣成分的影響

相比堿濃度和溫度，固液比對甘蔗渣主要成分的影響趨勢有所不同。無論是半纖維素、纖維素還是木質素含量都呈現先下降后升高的趨勢。在固液比為1︰12時，半纖維素含量最低，為10.56%，在固液比為1︰14時，纖維素和木質素含量最低，分別為40.33%和15.63%。在固液比為1︰8時，半纖維素含量、纖維素含量和木質素含量均最高，分別為 16.35%、45.83%和 17.55%(圖 3)。

圖3 不同堿處理固液比對甘蔗渣成分的影響

隨著處理時間的增加，纖維素含量和木質素含量均呈現逐漸下降的趨勢，處理時間從10 min到50 min，纖維素含量由46.12%下降到38.25%，木質素含量由18.24%下降到15.23%。半纖維素含量在處理40 min后達到最低為10.03%(圖4)。

圖4 不同堿處理時間對甘蔗渣成分的影響

利用NaOH預處理甘蔗渣，不同的處理條件對甘蔗渣成分均存在一定程度的影響。隨著NaOH濃 度、溫度和處理時間的增加，半纖維素、纖維素和木質素含量總體呈現逐漸降低的趨勢，這是因為，用NaOH處理甘蔗渣可以破壞細胞壁溶解半纖維素和木質素通過水解成為糖醛酸和乙酸酯，降低纖維素的結晶度。NaOH濃度和處理溫度越高，處理時間越長，甘蔗渣物理結構破壞越嚴重，通過該方法，可以將甘蔗渣簡單地分餾成堿溶性木質素、半纖維素和殘留物，利用它們獲得更有價值的產品。甘蔗渣經過NaOH預處理可以消化木質素，并使纖維素和半纖維素用于水解[19]。研究發現用1%和3%NaOH溶液連續處理甘蔗渣，可從蔗渣中得到 25.1%半纖維素，占原始半纖維素的74.9%[20]。本研究還發現，不同固液比對甘蔗渣成分影響較小，表明固液比不是NaOH預處理甘蔗渣的關鍵因素。

2.2 不同堿處理對甘蔗渣固體得率的影響

不同堿濃度對甘蔗渣固體得率有一定影響，但變化不明顯，堿濃度處理固體得率在 53.2%～61.12%之間，10%左右的堿濃度固體得率最低圖5)。不同溫度對甘蔗渣固體得率影響較大，在30℃時，甘蔗渣固體得率最高為98.25%，在50℃時，甘蔗渣固體得率最低為54.2%(圖6)。而不同固液比和處理時間對甘蔗渣固體得率幾乎沒有影響(圖7和圖8)。

本研究發現，處理溫度為50℃時，固體得率最低，而過低或者過高的溫度都會使固體得率升高。這是由于溫度過低時，不利于化學反應的進行，固體降解速率較低。但是溫度過高會降低NaOH對半纖維素和纖維素的化學作用，從而保持一個較高的固體得率水平。

2.3 不同堿處理對甘蔗渣物理結構的影響

圖5 不同堿濃度對甘蔗渣預處理固體得率的影響

圖6 不同堿處理溫度對甘蔗渣預處理固體得率的影響

圖7 不同堿處理固液比對甘蔗渣預處理固體得率的影響

圖8 不同堿處理時間對甘蔗渣預處理固體得率的影響

對不同堿處理后的甘蔗渣物理結構進行電鏡照相，結果表明：不同堿濃度、溫度、固液比和處理時間對甘蔗渣物理結構都有不同程度的影響。從結果可以看到對照樣品蔗渣原料結構完整緊密，纖維素束排列有序，原料表面光滑、平整，幾乎看不到內部形態(圖9)。而用濃度10%或13%的NaOH處理后，可清晰觀察到蔗渣結構受到破壞，內部結構變得疏松多孔，表面剝離出纖維碎片，多處出現小孔(圖 10)。70℃處理甘蔗渣后可以觀察到，甘蔗渣表面出現多個孔洞，甚至出現較大的縫隙，木質素和纖維素結構已基本破壞。不同固液比對甘蔗渣處理后甘蔗渣表面出現一定程度的破壞，但效果不明顯，大部分結構還保持原狀(圖 11)。處理時間對甘蔗渣影響較大，處理30 min后甘蔗渣表面開始出現小孔，進一步處理后蔗渣表面變得更加崎嶇、凹凸不平，纖維出現部分剝離，表面小孔變多變密(圖12)。

使用NaOH預處理甘蔗渣后，甘蔗渣的物理結構破壞比較嚴重，綜合來看，NaOH濃度、處理時間和溫度對物理結構影響較大。這是因為甘蔗渣半纖維素在纖維細胞壁的分布以次生壁外層濃度最大，而且半纖維素以粘合劑方式存在于細胞壁各薄層間，因而半纖維素脫除后，會使纖維細胞壁嚴重分層。使得原料表面變得粗糙，組分溶出而出現小孔[21]。進一步酶解后，蔗渣表面變得更加崎嶇、凹凸不平，纖維出現部分剝離，表面小孔變多變密。可以觀察到，酶解后的原料殘渣的結構仍較完整，這是由于酶解后的蔗渣仍含有較多未被水解的纖維素，它們仍被木質素緊密連接在一起。

圖9 不同堿濃度對甘蔗渣物理結構的影響

圖10 不同堿處理溫度對甘蔗物理結構的影響

圖11 不同堿處理固液比對甘蔗渣物理結構的影響

圖12 不同堿處理時間對甘蔗渣物理結構的影響

圖13 不同堿濃度對甘蔗渣酶解效率的影響

2.4 不同堿處理對酶解效率的影響

利用不同預處理條件下的 NaOH預處理甘蔗渣，實驗結果如下：隨著NaOH濃度的增加，酶與纖維素內部及表面積逐漸增加，從而使還原糖質量分數逐漸增加；當NaOH濃度增加到10%后，隨著濃度的繼續增加，還原糖質量分數略有下降(圖13)。所以選擇堿濃度為 10%。隨著溫度的升高，木質素越易脫除，還原糖含量不斷地增加；當溫度上升至50℃以后，還原糖含量下降(圖 14)。因此，選擇溫度為50℃。隨著固液比的增加，還原糖質量分數變化不明顯，當固液比為1︰16時，略有升高，這是因為當固液比低于1︰8時，木質素不易被脫除，當增加到一定程度后，還原糖質量分數與固液比達到一個平衡點，所以最佳固液比為 1︰16(圖 15)。如果處理時間太短，NaOH不能完全脫除木質素，影響水解效率；如果處理時間過長，會使纖維素部分溶解而減少處理液中的糖含量。考慮到糖產量和節約時間，選擇處理時間為30 min左右(圖16)。

和甘蔗渣成分相比較，酶解過程更為復雜，過高的NaOH濃度、預處理溫度和時間都會阻礙酶解的進行。隨著濃度增加，有效堿對碳水化合物的損害作用增加，多余的NaOH會使纖維素遭到破壞。當溫度上升至50℃以后，還原糖含量下降，這是因為當溫度升高到一定值時，部分還原糖容易發生分解反應，生成糠醛等副產物，使還原糖含量降低，還原糖質量分數略有下降。經過不同處理對甘蔗渣處理的結果，得出最佳的處理條件為：NaOH濃度10%，溫度50℃，固液比1︰16，處理時間30 min。在這個條件下，甘蔗渣降解成還原糖的效率最高，還原糖濃度大約在16%左右。

圖14 不同溫度對甘蔗渣酶解效率的影響

圖15 不同固液比對甘蔗渣酶解效率的影響

圖16 不同處理時間對甘蔗渣酶解效率的影響

3 結論

本文利用NaOH預處理甘蔗渣，通過不同濃度、溫度、固液比和處理時間對甘蔗渣成分含量、固體得率、物理結構和酶解效率進行了研究。結果表明：NaOH濃度、預處理溫度和預處理時間是影響甘蔗渣成分的關鍵因素。處理溫度對固體得率影響較大，而濃度、固液比和處理時間的影響不明顯。不同堿濃度、溫度、固液比和處理時間對甘蔗渣物理結構都有不同程度的影響，處理后的甘蔗渣物理結構受到破壞，內部結構變得疏松多孔。根據酶解效率實驗得出的最佳預處理條件為：濃度10%、溫度50℃、固液比1︰16、處理時間30 min，其預處理甘蔗渣產物還原糖濃度在16%左右。