顆粒酶A 在腫瘤免疫中的功能研究

顧亞茹 郭長纓*

（中國藥科大學生命科學與技術學院，江蘇 南京211198）

顆粒酶屬于絲氨酸蛋白酶家族，在人類中，主要表達了五種顆粒酶（GzmA，GzmB，GzmH，GzmK 和GzmM），顆粒酶的氨基酸序列具有約40%的同源性，顯示相似的胰蛋白酶樣結構，并共享催化三聯體殘基His，Asp 和Ser[1]。20 多年來，穿孔蛋白和顆粒酶一直被認為是細胞毒性T 細胞(Tc)和自然殺傷(NK)細胞在癌癥免疫監測中發揮關鍵作用的執行者[2]。

1 GzmA 結構

目前已經得到關于顆粒酶A 高分辨率的晶體結構[3-4]。GzmA形成穩定的二硫鍵連接的同型二聚體，并以不依賴caspase 的方式觸發靶細胞死亡[5]。由于GzmA 單克隆抗體不能識別pro-GzmA，因此，活化后的顆粒酶A 可能發生了構象的改變[6]。已有實驗驗證，當把核裂解物與胰蛋白酶一起孵育過夜時，大多數蛋白質會降解。但是，在與相似濃度的GzmA 孵育過夜后，大多數蛋白質條帶保持不變[7]。因此，GzmA 的結構決定了它對底物的高特異性。

2 GzmA 合成、加工、傳遞過程的細胞生物學活性

在顆粒酶的合成，加工和存儲過程中，有幾種機制可確保它在殺傷細胞內沒有活性，以保護其不破壞宿主細胞。所有顆粒酶均被合成為無活性的前體分子，前體包含將其引導至內質網（ER）的信號序列和N 端二肽，N 端二肽僅在細胞毒性顆粒中被組織蛋白酶C（二肽基肽酶I）去除，使GzmA 從無活性狀態轉變為成熟的有活性的顆粒酶A[8]。當殺傷細胞與靶細胞結合而被激活時，細胞毒性顆粒向免疫突觸移動，細胞毒性顆粒膜與殺傷細胞質膜融合，將顆粒內容物釋放到免疫突觸中[9]。在靶細胞與CTL 細胞之間的免疫突觸中釋放出顆粒內容物后，顆粒酶借助穿孔素進入靶細胞，特異性切割各種蛋白底物[1]，發揮免疫效應。

3 GzmA 的抑制劑

內源性抑制劑對蛋白水解酶的調節對于維持體內穩態和防止不良損害至關重要。盡管細胞毒性T 細胞內的顆粒酶轉運機制最大程度地減少了活性酶從顆粒中的泄漏，但是仍然會有漏網之魚可能導致細胞死亡[10]。所以一個重要的問題是CTL 如何保護自己免受細胞毒性分子的侵害？

第一種保護機制是在顆粒融合過程中將能夠將蛋白水解滅活穿孔素的細胞毒性顆粒膜蛋白（組織蛋白酶B）外化到殺傷細胞質膜上。第二種是是殺傷細胞表達絲氨酸蛋白酶抑制蛋白。絲氨酸蛋白酶抑制劑是一個大的蛋白酶抑制劑家族，可以通過共價和不可逆方式地結合到酶活性位點上使其靶向失活[11]。第三種顆粒酶A 抑制劑是胰腺分泌胰蛋白酶抑制劑（PSTI）[12]，在患有炎癥和組織破壞的患者的血液中被發現（124,125）。除此之外，還有幾類合成的外源性抑制劑，包括異香豆素衍生物，肽氯甲基酮和肽膦酸酯（121）也是研究和潛在治療應用的有力工具。

4 GZMA 對腫瘤的調控機制

細胞毒性T 淋巴細胞和自然殺傷細胞是人體持續防御病毒感染和腫瘤發展必不可少的因素，主要通過兩條途徑殺死感染或異常的靶細胞，將一系列顆粒酶引入靶細胞，或通過TNF 超家族依賴性殺傷。在依賴顆粒酶的殺傷過程中，由多種顆粒酶介導，使靶細胞快速有效的死亡[13]。GzmA 可能通過多種途徑促進靶細胞死亡，但內質網相關的SET 復合物組分的蛋白水解被認為是該顆粒酶導致細胞死亡的主要機制[14]。GzmA 對含有SET（也稱為HLA 相關蛋白II 或PHAPII），PHAPI（pp32，富含亮氨酸的酸性核蛋白）和HMG2 的270-420 kDa 的高分子蛋白復合物進行水解，可釋放NM23-H1（一種依賴Mg2+的DNase），導致核DNA 單鏈斷裂[5]和其他凋亡特征，包括核碎裂、染色質凝聚、線粒體電位喪失和膜起泡等[15]。

5 GZMA 促炎作用

盡管有關GzmA 的大多數文獻都集中于其在細胞死亡中的作用，但是首先發現的GzmA 的底物是白介素（IL）-1β[16]。GzmA激活該關鍵促炎細胞因子，暗示著GzmA 可能在炎癥調節中起著重要的作用。越來越多的證據表明顆粒酶調節炎癥，促進單核細胞和巨噬細胞分泌促炎因子[17]。因此，除了作為細胞死亡效應分子傳遞到靶細胞外，顆粒酶還可能具有釋放到細胞外空間的活性。目前已知，有感染性疾病和炎性疾病的患者胞外顆粒酶A 水平升高。例如類風濕性關節炎、敗血癥以及病毒或細菌感染的患者滑液、血漿，血清或支氣管肺泡灌洗液中的顆粒酶水平升高[18-20]。GzmA 還可以增強人單核細胞TLR 信號傳導和細胞因子的釋放。但是目前其促炎因子釋放的分子機制仍然未知[21]。

6 討論

分子、結構和細胞生物學的相關研究進展增強了我們對GzmA 的功能性研究。為了了解對各種炎癥和腫瘤疾病的易感性，穿孔素- 顆粒酶途徑的研究越來越多，希望能在有關免疫系統如何殺死腫瘤細胞以及腫瘤內炎癥方面有更多的了解，使得免疫療法效果得到進一步提高。

根據目前研究結果發現GzmA 除了在免疫細胞中表達并發揮抗腫瘤功能外，在腫瘤細胞中也有微量存在。但是是否所有腫瘤細胞中GzmA 都表達，以及發揮什么樣的生理功能仍然是未可知的，因此，在GzmA 與腫瘤的相關研究方面還有許多問題亟待解決。