高糖環境對骨生成影響的細胞生物學相關機制

李雅欣 劉加強

糖尿病(diabetes mellitus，DM)[1]是一種多病因的代謝疾病，特點是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質代謝紊亂，可導致骨骼系統紊亂、血管并發癥和組織愈合延遲等多種問題。其中β 細胞被破壞，胰島素絕對缺乏為1 型糖尿病(T1DM)，胰島素抵抗伴胰島素相對不足，或胰島素分泌缺陷為2 型糖尿病(T2DM)。口腔疾病與糖尿病之間的聯系復雜多樣，如牙周炎[2]，列糖尿病的并發癥第六位，表現為牙周支持組織不可逆損傷、牙槽骨吸收和牙齒脫落。此外，糖尿病患者種植體周圍炎的患病率同樣增高，種植體骨整合過程中的骨-種植體愈合均延遲，特別是愈合期間在骨鈦界面處發生的成骨細胞生物學功能下降[3]。口腔臨床中常見因腫瘤、牙周病、發育畸形和外傷等因素所致的顏面骨組織缺損，而糖尿病可誘發全身糖尿病性骨質疏松(diabetic osteoporosis，DOP)，患者骨量減少，骨組織顯微結構受損，骨脆性增加，骨折愈合和骨缺損修復功能受損，身心健康受到嚴重影響。

上述臨床問題與糖尿病環境下的骨形成的細胞學機制密切相關，目前體內研究主要是通過建立嚙齒動物的糖尿病模型來實現，其中1 型糖尿病的實驗模型大多通過注射鏈脲佐菌素(STZ)誘導胰島β細胞損傷來建立，2 型糖尿病的模型通常將小鼠暴露于高脂飲食和注射中等劑量的STZ 而建立。體內研究大多涉及潛在治療藥物選擇或者材料改進問題，結果表明了糖尿病的整體負面作用，更多的研究聚焦體外模擬糖尿病環境下具體細胞生物學特性的改變及相關信號通路。最常用的方法為高糖培養，考慮到糖尿病患者體內復雜微環境，也有少許研究通過添加糖尿病動物模型來源的血清進行細胞培養。本文將針對糖尿病對骨生成的細胞生物學機制進展作一綜述，重點闡述體外實驗下高糖刺激對具體細胞的多種影響和相關分子機制。

1.高糖環境對間充質干細胞的影響

間充質干細胞擁有自我更新及多向分化的潛能，是骨組織再生的重要種子細胞。在體外特定誘導下，可向成骨細胞、網狀細胞等多種的細胞譜系分化，其中成骨、成血管和成脂分化的調控對于維持骨穩態十分重要。

骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)向成骨細胞方向分化，是骨生成的關鍵，影響種植體骨結合以及頜骨缺損修復。與正常人牙槽骨來源的BMSCs 相較，糖尿病患者的BMSCs增殖能力受抑，凋亡率增高[4]。同時，高糖壓力下骨髓間充質干細胞表現出早衰傾向，衰老相關炎性細胞因子IL-6 等分泌增多，BMSCs 可能是通過自噬介導的衰老來避免凋亡以保持細胞存活。高糖誘導下的BMSCs 功能障礙還體現在其成骨分化受抑，Runx2、osterix 和β-catenin 等相關轉錄因子表達降低，成骨細胞及其前體基質礦化的重要標志堿性磷酸酶ALP 活性下降，Jiang 等用Sonic hedgehog(Shh)慢病毒載體轉導的BMSCs 細胞中，HG 對BMSCs 成骨分化的抑制作用被逆轉，證明了高糖刺激影響了BMSCs 的Shh 信號通路[5]。同時氧化應激反應增強，大量的ROS 損傷血管內皮細胞，干細胞的成血管能力也有所下降，而成脂分化受誘導增強。

除了骨髓間充質干細胞外，也有少許研究聚焦糖尿病性牙周炎患者的牙槽骨重塑的關鍵細胞——牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)，體外高糖壓力下引起PDLSCs 的氧化應激反應，其增殖和成骨能力受抑，上調細胞自噬能力和加入抗氧化劑如促紅細胞生成素可部分恢復其成骨能力[6，7]，miR-31 抑制劑也可在mRNA 和蛋白質水平上促進礦化骨基質的形成并增強Runx2和OCN 表達[8]。因此，改善高糖狀態下的自體干細胞成骨及成血管活性，扭轉其功能受限局面成為臨床關鍵問題。

2.高糖環境對成骨-破骨動態平衡的影響

2.1 高糖環境對成骨細胞的影響 成骨細胞(osteoblast，OB)是參與骨形成的主要功能細胞之一，在骨骼生長發育及骨量維持方面扮演著關鍵角色。大多數研究表明，OB 暴露在高糖環境中，其增殖能力降低，細胞外基質合成不良，后續成熟及礦化均受到影響，不利于骨形成及骨量的維持。最近體外實驗證明，高糖環境可通過焦磷酸化途徑即caspase-1/ GSDMD/ IL-1β 途徑激活細胞凋亡，抑制牙槽骨中成骨細胞的增殖和分化[9]。

經典的Wnt/ β-catenin 途徑是成骨細胞功能和骨形成的重要調節劑，高糖刺激可以靶向經典Wnt 通路的不同成分使信號轉導途徑受抑。最新研究發現[10]，與Wnt 通路相關的半乳糖凝集素-3(GAL-3)，可在循環中結合和降解晚期糖基化終末產物(advanced glycation end products，AGEs)，骨細胞分泌包含miR-124-3p，GAL-3 和IL-6 的外泌體，后被成骨細胞內吞。高糖條件下，外泌體內miR-124-3p 含量增加，靶向抑制成骨細胞中的Gal-3 的表達，導致Runx2 表達下降和IL-6 含量增加。除Wnt 通路外，Li 等[11]在探究能量穩態和骨骼重塑是否通過Hippo 信號通路相關聯時發現，高糖可抑制成骨細胞中Hippo 通路上游核心成分Mst1/ 2Mst1/ 2 激酶的活性，后續成骨細胞中主要的葡萄糖轉運蛋白Glut1 表達下降，AMPK被激活，Runx2 泛素化降解，成骨細胞分化和骨形成受抑，且Mst1/ 2 激酶對Glut1 表達的調節獨立于Yap/ Taz 表達。

高糖改變生物礦化的過程，抑制成骨細胞的礦化和成骨標記物(ALP、Runx2、I 型膠原、OCN)的表達，并促進脂肪生成標記物(PPARγ、aP2、抵抗素)的表達，具體機制尚不清楚。有研究認為，25.5mmol/ L 高糖可能會降低成骨細胞MC3T3-E1中的雌激素或雌激素受體ERα 信號傳導從而抑制骨形成，連同其誘導產生的ROS 共同抑制PI3K/Akt 和β-catenin 信號通路，來促進成骨細胞的成脂作用[12]。但是，A.García-Hernández 等[13]發現用濃度為24mmol/ L 的葡萄糖(正常葡萄糖濃度為5.5mM)孵育成骨細胞時，骨唾液蛋白(BSP)、骨鈣蛋白(OCN)和轉錄因子Runx2 的表達增加。在其他細胞如人牙周膜成纖維細胞中，高糖刺激也增強了細胞礦化作用[14]，對于上述兩種相反結論，可能與成骨細胞及其前體細胞對高糖環境的反應性與細胞來源、培養類型(原帶培養、傳代培養、或細胞系)以及成骨分化階段等因素有關。但一致結論是，過量的葡萄糖導致成骨細胞ALP 活性下降，導致鈣與磷酸鹽沉積的不平衡，最終形成質量不佳的礦物質。

有學者認為，單一高糖培養不能模擬體內復雜糖尿病環境，因此研究成骨細胞在糖尿病環境中的功能活性變化，往往與炎性細胞因子和氧化應激相結合。在體外高濃度葡萄糖處理的成骨樣MG-63細胞中，mRNA 和蛋白水平上都可以檢測到腫瘤壞死因子(TNF)-α 表達增加，與體內結果一致。單獨用TNF-α 于刺激高糖條件的成骨細胞時發現，其與高糖協同降低細胞活力，促進細胞凋亡[15]。高糖環境下成骨細胞內線粒體和細胞質中的ROS 升高，其增殖，成骨分化和礦化能力降低[16]。體外實驗也可加入過氧化氫常模擬糖尿病的氧化環境，結果一致。針對此，一些抗氧化劑如α-硫辛酸可維持線粒體穩態來調節在高糖誘導下氧化應激狀態的成骨細胞分化。胰島素也被證實可通過上調一氧化氮/ 環GMP/ cGMP 依賴性蛋白激酶(NO/ cGMP/PKG)轉導信號，降低炎性因子含量和氧化應激水平，來促進高糖環境下成骨細胞增殖、分化和存活[17]。了解高糖對成骨細胞分化和基質礦化沉積作用的潛在機制，可能為未來糖尿病相關的骨流失修復的治療和預防方法提供新的見解。

2.2 高糖環境對破骨細胞前體及破骨細胞的影響 頜骨是人體骨組織代謝中最為活躍的部分，時刻不斷地進行更新和改建，除了骨髓間充質干細胞來源的成骨細胞引導骨生成，也伴隨由造血細胞來源的破骨細胞(Osteoclast，OC)主導的骨吸收。體外實驗常用小鼠巨噬細胞Raw264.7 細胞系或骨髓巨噬細胞(bone marrow macrophage，BMM)來研究破骨細胞的分化。糖尿病環境中破骨細胞形成和分化結果似乎是矛盾且爭議的，其中的機制更為模糊與復雜。

一些人體研究表明，T2DM 患者血清中的抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)水平升高，這是破骨細胞活性增加的指標，表明破骨細胞功能增強。動物研究還表明，在T1DM 和T2DM 糖尿病小鼠模型中，破骨細胞的活性和形成量大大增加，導致骨吸收能力提高。而大部分細胞實驗認為高糖可通過降低ROS產生、caspase-3 和NF-κB 活化來干擾RANKL信號傳導，來直接或間接抑制破骨細胞的分化和功能。如Dong W 等認為高糖(16.5mmol/ L)促進AMPK 的表達來抑制破骨細胞分化和骨吸收[18]。Cai 等[19]將破骨細胞暴露于低葡萄糖(5.5mmol/ L)中發現AMPK/ mTOR/ ULK1 信號軸上調且激活自噬，證實高葡萄糖以劑量依賴的方式抑制破骨細胞的形成和功能，但不影響RAW264.7 細胞的增殖。但也存在少許相反結果，如An Y 等[20]人發現高糖(35 mmol/ L)可以顯著激活OC 中MAPK、NF-κB 以及NLRP3 炎性體相關蛋白的表達，誘導增強了破骨細胞的骨吸收能力，且抑制了細胞胞吞作用，而這種現象可被胰島素所逆轉，體外實驗差異結果可能與細胞譜系的異質性和葡萄糖濃度等孵育條件之間的差別有關。

考慮到糖尿病患者和動物體內除血糖外，以棕櫚酸為主要成分的游離脂肪酸(FFA)水平也有明顯增加，Qu B 等聯合高糖刺激和棕櫚酸酯(PA)的組合模擬T2DM 微環境，結果表明高糖和FFA 的組合利于破骨細胞的分化，不僅TRAP 陽性多核細胞的數量增加，而且RANK 和RANKL 的表達同樣增強，而OPG 表達水平降低[21]。

2.3 高糖環境對成骨-破骨細胞系統的影響為了維持相對穩定的骨骼體積和質量，通過細胞譜系之間及內部的通訊，成骨細胞和破骨細胞的功能受到嚴格調節。破骨細胞的形成和分化主要受成骨細胞分泌的細胞外RANK/ OPG/ RANKL 系統調節，OPG/ RANKL 的比率降低會促進破骨細胞分化。高糖(16.7mmol/ L)主要影響成骨細胞中OPG的表達，而不是RANKL。Cunha JS 的實驗[22]也證明了在30mmol/ L 的高葡萄糖誘導條件下，成骨細胞的RANKL mRNA 水平增加了2 倍，而OPG 的mRNA 水平增加了30 倍，RANKL 的量相對于OPG 不值一提，預估其無法與破骨細胞中的RANK結合，造成骨吸收減少，新的成骨細胞的募集受限，骨重塑的動態循環不良，進而導致骨質疏松，文章認為這可能解釋了無動力型骨病的發病機理。

除RANK/ OPG/ RANKL 調節系統外，破骨細胞和成骨細胞的分化也受EphB4/ EphrinB2 分子機制調控，成骨細胞中的EphB4 分子增強成骨細胞分化，破骨細胞前體中的EphrinB2 分子抑制破骨細胞分化，Wu Min 等[23]在體外和體內實驗中也證明了高糖導致EphB4/ EphrinB2 的表達失調。除此之外，高糖環境也可通過影響骨細胞-破骨細胞通訊來干擾骨骼代謝，Maycas M 等[24]在比較高糖對小鼠骨樣MLO-Y4 細胞和成骨細胞系MC3T3-E1 這兩種細胞系與破骨細胞前體RAW 264.7 相互作用的影響時發現，預先暴露于高糖環境下的的MLO-Y4 細胞條件培養基(CM)中RAW 264.7 細胞遷移受抑，而同樣條件的MC3T3-E1 細胞CM的影響并不明顯，前者形成了對羥磷灰石的吸收活性很小的破骨細胞樣細胞。

3.糖尿病血清培養下的骨生成細胞研究

選用糖尿病血清還是單一高糖刺激一直存有爭議，理論上糖尿病血清是最接近體內環境的刺激物，其不僅包含高葡萄糖，還附加真實病理刺激，如高脂和炎性細胞因子。但目前相關研究較少，多集中在改善糖尿病患者的種植體骨結合時成骨細胞活性的生物材料領域，如Ma 等[25]在多孔鈦合金植入物表面進行培養成骨細胞發現，加入糖尿病血清后產生過量ROS 損害成骨細胞粘附力，同時成骨分化中起著至關重要的BMP-2 信號通路受抑，后續ALP 活性，骨鈣素生成和基質礦化相應減弱，也可能與ROS 介導的PI3K/ AKT 途徑受抑有關[26]。整體看來，添加糖尿病血清研究與廣泛采用的高糖或聯合其他炎性細胞因子等成分刺激體外研究結論基本一致，但糖尿病血清的具體成分質和量均難確定，是否存在不同供體來源血清異質性問題，這仍然值得思考。

4.展望

糖尿病患病率居高不下，患者體內長期糖尿病環境通過影響骨生成過程中相關細胞的增殖、遷移、分化、凋亡等各種功能，導致牙周炎嚴重骨流失，種植體的骨結合受阻，頜骨等骨質疏松及骨折發生的風險加大，阻礙顏面頜骨骨折愈合和骨缺損修復。糖尿病環境十分復雜，高糖刺激、氧化應激和炎性細胞因子的協同作用不可忽視，大量體內實驗和體外實驗均證明了高糖環境的負面作用并猜測了相關分子機制，也存在一些疑慮矛盾問題和結果需要思考。本文回顧了近幾年來糖尿病環境對骨生成的細胞生物學機制，闡述了相對矛盾的實驗結果及其細胞來源、高糖濃度、以及培育條件，希望為廣大科研工作者提供信號通路靈感和實驗設計建議。最重要的是，依據細胞實驗推斷出的潛在治療靶點或方式，是否能在臨床治療的不同階段扭轉糖尿病患者體內骨生成的不利局面，尚需要進行更多體內實驗和臨床試驗來評測，比如選擇何種適宜的細胞調控因子，如何將藥物或者調控因子高效結合新型復合材料，或者修飾或改變材料的表面形貌。同時鼓勵更換思路開發耐受糖尿病環境的骨結合、骨修復新藥新材料，從而提供一個最佳微環境，最大化地激發其骨形成相關細胞的潛能，更好地服務于臨床，緩解糖尿病患者的身心痛苦。