D-半乳糖誘導正常人口腔黏膜角質形成細胞衰老的研究*

張倩倩 劉麗駿 徐 盼 孫 陳 蔣偉文

正常人口腔黏膜角質形成細胞(normal human oral keratinocytes，NHOKs)是口腔黏膜上皮重要組成細胞，發揮防御、感覺等功能。衰老過程中，黏膜結構改變，功能受損，病變風險增加[1，2]。過量D-半乳糖(D-galactose，D-gal)能誘導細胞代謝發生改變，使活性氧(reactive oxygen species，ROS)產量增加，出現氧化應激，造成細胞損傷，發生衰老[3]。此時細胞周期停滯，細胞周期抑制蛋白p53，p21 表達升高，衰老相關半乳糖苷酶活性升高[4，5]。Sirt1 是sirtuin 蛋白家族一員，是具有NAD+依賴的去乙酰化酶活性蛋白，保護細胞免受氧化應激，衰老過程中表達下調，起到抗衰老作用[6，7]。D-gal 已被廣泛用于構建多種器官組織衰老模型[8，9]，但在NHOKs 中的作用罕見報道。本實驗旨在研究D-gal 可否誘導NHOKs 衰老，探索其潛在作用機制為體外構建口腔黏膜衰老模型提供理論依據，對研究口腔粘膜黏膜老化、治療口腔腫瘤疾病提供新的策略和思路。

1.材料與方法

1.1 主要材料 試劑主要試劑OKM 培養基(Sciencell)、DispaseⅡ中性蛋白酶(Roche)、鼠尾膠原、胰蛋白酶、青鏈霉素(Gibco)、磷酸鹽緩沖液PBS(Hyclone)、細胞角蛋白抗體PCK、細胞波形蛋白抗體Vimentin(Gene tech)、CCK-8 試劑盒(新賽美)、D-半乳糖(北京索萊寶)、衰老相關β-半乳糖苷酶染色試劑盒、RIPA 裂解液、ROS 檢測試劑盒(上海碧云天)、p53 抗體、p21 抗體、GAPDH 抗體、Actin 抗體(Cell Signaling)、sirt1抗體(SANTA CRUZ)。

1.2 細胞培養與鑒定 (1)NHOKs 原代培養從18～60 歲因拔除阻生齒的健康患者處，獲得健康口腔黏膜組織。本研究通過上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院醫學倫理委員會批準(批件號：滬九院倫審2018-63-T54 號)。患者入診室后經專人評估基本情況，符合要求者，征得其允許后，由醫生進行口腔黏膜組織取材。取材部位靠近阻生齒，大小約5mm×5mm，避免過多過大取材對患者造成不必要的傷害。樣本取后立即保存于10%雙抗PBS 溶液中運輸至實驗室，于無菌條件下去除組織下層多余的脂肪，用0.25%DispaseⅡ中性蛋白酶4℃過夜消化，分離上皮層，剪成約1mm3小塊，用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA 溶液于37℃、5%CO2細胞培養箱中充分震蕩消化3min，離心，OKM 培養基重懸獲得單細胞懸液，置于37℃、5%CO2飽和濕度細胞培養箱中，隔三天換一次液。當細胞密度達到70%～80%傳代。本次研究使用P2 代細胞用于后續實驗。

(2)NHOKs 細胞鑒定將P2 代NKOKs 以1×105個/ mL 的密度接種于放置細胞爬片的24 孔板中，細胞達到70%時，用4%多聚甲醛固定爬片15min，PBS 洗三次。0.1%Triton-X 通透細胞30min，PBS 洗三次。于不同孔中分別滴加一抗角蛋白抗體和波形蛋白抗體，室溫孵育1h，PBS 洗三次。生物素標記二抗室溫孵育半小時，PBS 洗三次。DAB 顯色2min，蘇木素復染2min，鹽酸脫水，清水沖洗晾干，中性樹膠封片。于光學顯微鏡下觀察、攝取圖像。

1.3 CCK-8 檢測 細胞增殖活力將細胞懸液以5×104/ ml 密度種于96 孔板中，24h 后細胞貼壁，分別用0、10、20、40、80g/ L 的D-半乳糖處理細胞12h、24h、48h。0g/ L 作為對照組。每孔加入10ul CCK-8 溶液，37℃孵育4h，酶標儀檢測450nm 處吸光值，計算增殖活力。

1.4 β-半乳糖苷酶染色 使用衰老相關β 半乳糖苷酶染色試劑盒進行衰老相關的β 半乳糖苷酶(senescence-associated-β-galactosidase，SA-βgal)染色，檢測細胞衰老水平。在光學顯微鏡下攝取圖像，取三個視野，每個視野300 個細胞，計算SA-β-gal 陽性細胞百分率。

1.5 ROS 含量檢測 將細胞懸液以5×104/ ml密度種于24 孔板中，24h 后細胞貼壁。20g/ L D-半乳糖作用細胞。分別于12h、24h、48h 時向每孔加入250μL 稀釋好的DCFH-DA，細胞培養箱孵育20min。用無血清培養液洗滌細胞3 次，充分去除未進入細胞的探針。檢測488nm 激發波長，525nm 發射波長下的熒光值。

1.6 Western bolt 分析 細胞蛋白表達收集D-半乳糖處理過的NHOKs，RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，BCA 蛋白定量檢測樣品濃度，用5×蛋白上樣緩沖液將樣品稀釋至同一濃度，使用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉模至0.2μm 的PVDF，封閉液室溫封閉1h，目的蛋白一抗4℃孵育過夜，HRP 標記的二抗于室溫孵育1h，使用ECL 顯影液于凝膠成像分析儀中采集信號，分析目的蛋白灰度值。

1.7 統計分析 所有計量資料采用均數±標準差描述，應用Graphpad Prism 5.0 統計分析、作圖，采用單因素和多因素方差分析比較組間差異，P＜0.05 作為差異有統計學意義，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.001。

2.結果

2.1 NHOKs 原代培養與細胞鑒定 細胞呈多邊形，邊界清楚，鋪路石狀，貼壁單層生長，肉眼見無混雜的成纖維細胞，符合NHOKs 形態學特征(圖1A)。角蛋白免疫細胞化學染色呈陽性(圖1B)。波形蛋白染色成陰性(圖1C)。結果表明所培養的細胞特異性表達細胞角蛋白，但不表達波形蛋白，為角質形成細胞，并且無成纖維細胞混雜。

圖1 NHOKs 細胞形態與細胞鑒定

2.2 D-半乳糖抑制細胞增殖活力 在NHOKs中加入0、10、20、40、80g/ L 的D-半乳糖，處理12h、24h、48h，結果顯示，D-半乳糖濃度越高，處理時間越長，細胞增殖活力越低(圖2)。與對照組相比，20g/ L、40g/ L 處理48h 具有統計學差異(P＜0.001)。80g/ L 處理12h、24h、48h，與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.001)。D-半乳糖抑制細胞增殖活力，具有濃度依賴性和時間依賴性。選擇20g/ L 處理細胞48h 進行后續實驗。

2.3 D-半乳糖誘導NHOKs 發生衰老 D-半乳糖作用細胞后，SA-β-gal 陽性細胞數量明顯增加(圖3A，B)。細胞衰老相關蛋白p53 和p21 表達水平顯著升高(圖3C，D)。這些結果說明，D-半乳糖能夠誘導NHOKs 發生衰老。

圖2 D-半乳糖抑制NHOKs 增殖活力

圖3 D-半乳糖誘導NHOKs 發生衰老

2.4 D-半乳糖誘導NHOKs 衰老可能與氧化應激有關 與對照組相比，20g/ L D-半乳糖分別作用NHOKs 的12h、24h、48h 后，細胞內ROS水平逐漸升高(圖4A)。48h 時差異有統計學意義。Sirtuin-1(sirt1)是sirtuin 蛋白家族的一員，研究發現其與衰老過程的ROS 產生有關。本研究提取D-半乳糖處理了48h 的細胞蛋白，WB 結果顯示sirt1 表達顯著降低(圖4B，C)。因此，我們推測D-半乳糖誘導NHOKs 發生衰老可能與sirt1 相關的氧化應激過程有關。

3.討論

圖4 D-半乳糖誘導NHOK 衰老可能與氧化應激有關

口腔黏膜層起到防御、感覺、溫度調節和免疫等功能，角質形成細胞廣泛存在于皮膚和黏膜表層，口腔黏膜的角質形成細胞比皮膚具有更快的增殖、遷移能力[10]。口腔黏膜表面不斷受到各種機械、生物、化學刺激。并且菌群種類豐富，容易積累炎癥和免疫細胞，產生炎癥介質。隨著年齡增長，口腔黏膜彈性纖維減少，膠原束增厚紊亂，黏膜彈性變差，且微血管減少，上皮厚度減少，不僅導致黏膜組織防御能力下降，創口愈合能力降低，感覺功能減退[11]，對老年人后期義齒修復也帶來諸多困難[12，13]。加上吸煙等環境因素的影響，口腔黏膜發生癌前病變和惡性病變的風險增加[1，2]。因此，體外構建穩定的口腔黏膜衰老模型對研究口腔黏膜衰老有重大意義。本研究首次證實，D-gal 可以在體外誘導NHOKs 發生衰老。

細胞衰老具有線粒體功能障礙、基因組不穩定、衰老相關分泌表型、干細胞衰竭等表現等特征，主要機制包括ROS 產生、端粒酶縮短、線粒體損傷、細胞周期停滯等[5，14]。細胞衰老與線粒體功能障礙關系密切。當細胞的線粒體功能損傷，發生氧化應激，產生大量包括ROS 在內的自由基，被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素[15]。多種上皮細胞的衰老研究證實衰老過程中p53-p21 信號通路激活[16]，且衰老過程中sirt1 表達顯著降低。Sirt1 與細胞早衰關系密切，被認為是一種抗衰老因子[17]。參與應激反應、線粒體生物合成、增強代謝效率等[18]。

D-gal 是一種廣泛存在于乳制品、水果、蔬菜等食物中的單糖，可作為誘導衰老的人工老化藥物[19]。D-gal 誘導的老化垂體細胞與正常細胞相比，p53，p21 蛋白表達增加，p53/ p21 通路被激活[20]。D-gal 誘導大鼠心臟衰老的模型中，也發現p53-p21 通路被激活，同時ROS 含量升高并加速衰老[21]。P53 是一種轉錄因子，參與細胞周期調控、DNA 修復、細胞凋亡和細胞應激反應。P53激活可以誘導細胞生長停滯和調亡，還能調節細胞衰老和機體老化，對于腫瘤抑制和機體衰老至關重要[22]。P21 是DNA 損傷下p53 誘導細胞周期停滯，導致細胞衰老的重要調節因子。P53-p21 信號通路是調節細胞周期停滯和細胞衰老的經典通路[5]。晶狀體上皮細胞研究中發現，d-gal 不但抑制增殖，還具有時間和濃度依賴性[23]。本次實驗CCK-8 檢測結果顯示，與對照組相比，20g/ L、40g/ L、80g/ L 濃度的D-gal 對NHOKs 增殖具有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越顯著。各個濃度組均顯示12h、24h、48h 細胞增殖活力逐漸降低，20g/ L 開始，差異開始顯著。因此我們認為，D-gal抑制NHOKs 增殖，且具有濃度依賴和時間依賴性。我們通過WB 檢測20g/ L D-gal 誘導48h 的NHOKs 細胞周期相關通路蛋白p53 和p21 表達，發現D-gal 處理后，蛋白表達均下調，說明細胞周期停止，增殖受到抑制，這與以往研究結果一致。

Sirt1 是NAD+依賴性去乙酰化酶，也是細胞能量代謝的感受器。通過p53、NICD、FOXO、NF-κB 等多種途徑調節應激反應，發揮抗衰老作用[17]。NAD+/ NADH 比值增加從而激活sirt1。促進線粒體蛋白表達調節因子的活性，修復線粒體質量，降低ROS 產生，延長細胞壽命[24]。衰老細胞sirt1 表達下降與這一機制相一致。過量D-gal 誘導可線粒體功能障礙，出現氧化應激，產生大量ROS，損傷線粒體功能[19]。我們的數據顯示，20g/ L D-gal 誘導NHOKs 后，細胞ROS 含量隨時間延長而升高，48h 升高最顯著，此時sirt1 表達逐漸降低，48h 時達到最低。與上述研究一致。我們推測，D-gal 作用于NHOKs，線粒體功能出現障礙，導致電子傳遞過程電子泄露，ROS 產生增加，且由于NADH 呼吸鏈受損，NADH 無法繼續向NAD+傳遞電子，NAD+含量下降，NAD+/ NADH 比值降低，sirt1 活性抑制，對ROS 的調控作用下降。因此ROS 呈上升趨勢。

綜上所述，本研究證明D-gal 可在體外誘導NHOKs 發生早衰，這一過程可能與sirt1 參與調控的氧化應激反應相關。這一結論為體外構建口腔黏膜衰老模型提供依據，但尚需體內實驗進行驗證，以期為研究口腔黏膜老化提供更多工具。