大豆中3個Dof轉錄因子的生物信息學及表達分析

翟 瑩，邱 爽，張 軍，劉春雨，趙 艷，李珊珊，張梅娟，邱增城，任巍巍

(1.齊齊哈爾大學 生命科學與農林學院，抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省農業科學院 畜牧獸醫分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

Dof轉錄因子家族是植物中特有的一類轉錄因子，因其N端含有一個大概由52個保守氨基酸殘基構成的C2-C2型單鋅指結構域故而得名Dof(DNA binding with one finger)[1]。該家族屬于單鋅指蛋白超家族，一般由200～400個氨基酸構成。目前，已有多種植物Dof轉錄因子及蛋白被分離出來，如玉米[2]、小麥[3]、水稻[4]、馬鈴薯[5]等，并且在許多基因的啟動子中發現了Dof蛋白結合元件[6-7]。研究表明，Dof轉錄因子在植物種子萌發、碳氮代謝、光響應、逆境脅迫等過程中發揮重要作用[8-12]。

植物在遭受非生物脅迫時，會有大量的轉錄因子參與基因的表達調控，其中就包括Dof轉錄因子[13-14]。在馬鈴薯中鑒定的35個Dof基因中，大多數能被鹽、高溫、干旱及激素誘導上調表達[15]。茶樹中CsDof1和CsDof2能被低溫及高溫誘導上調表達[16]。而小麥的17個Dof轉錄因子中，多數則在干旱脅迫后下調表達[12]。盡管Dof轉錄因子能夠響應非生物脅迫，但其作用機制仍然不十分明確，應用Dof轉錄因子改良植物的例子也十分少見。

大豆是一種重要的經濟作物，但對大豆中Dof轉錄因子的研究目前僅限于種子發育等方面[17-18]。研究Dof轉錄因子對大豆應對非生物脅迫的影響對于改良大豆的抗逆性，提高其產量具有重要作用。本試驗從大豆中選取3個Dof轉錄因子進行生物信息學分析，并對它們在高鹽、干旱、低溫及高溫處理及葉、根、莖中的表達量進行檢測，以期為大豆Dof轉錄因子抗逆機制研究打下基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料

大豆品種北豆9號由齊齊哈爾大學植物分子育種研究室保存。

1.2 生物信息學分析

在大豆轉錄因子數據庫PlantTFDB(http://www.plantgdb.org/GmGDB/)中搜索Dof轉錄因子基因。通過序列比對，選取其中3個序列相似性較低的Dof基因進行以下分析。用在線軟件ExPASy(http://expasy.org/tools/pi_tool.html)預測蛋白的分子質量和等電點；用在線軟件PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行蛋白的亞細胞定位預測；用在線軟件NetPhos 3.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對蛋白磷酸化位點進行分析；利用NCBI數據庫(https://blast. ncbi. nlm. nih. gov/Blast. cgi)進行Dof同源基因的搜索；用DNAMAN軟件進行蛋白序列比對。在GmGDB(http://www.plantgdb.org/GmGDB/)數據庫中搜索Dof基因上游啟動子序列。用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)數據庫對啟動子中的順式作用元件進行預測分析。

1.3 非生物脅迫處理

使用Hoagland營養液，在16 h光照/8 h黑暗，25 ℃培養室內水培大豆幼苗。待大豆幼苗第1片三出復葉完全展開時進行以下處理。將大豆幼苗置于含150 mmol/L NaCl的營養液中進行高鹽迫處理；將大豆幼苗置于含15% PEG8000的營養液中模擬旱脅迫處理；將大豆幼苗置于4 ℃培養箱中進行低溫脅迫處理；將大豆幼苗置于42 ℃培養箱中進行高溫脅迫處理。分別在處理的0，1，2，5，10，24，36 h取樣，剪取0.1 g第1片三出復葉并迅速置于液氮中，同樣剪取未處理的大豆根和莖。以上材料均在-80 ℃超低溫冰箱中保存備用。

1.4 RNA提取及cNDA合成

使用TaKaRa RNAiso Plus分別提取上述1.3中各樣本的總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和OD260/280值檢測提取的RNA質量。使用Novoprotein cDNA反轉錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.5 實時熒光定量PCR

分別根據3個Dof基因的cDNA序列設計實時熒光定量PCR引物，以大豆組成型表達基因β-Tubuin(GenBank登錄號：GMU12286)為內參，4對引物序列如表1所示并送上海生工公司合成。在BIO-RAD CFX96 Real-time PCR儀上，對3個Dof基因在非生物脅迫及葉、根和莖中的表達量進行檢測。實時熒光定量PCR反應體系如下：2×TB Green Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa) 10 μL、cDNA 2 μL、上下游引物各0.8 μL，補水至總體積20 μL。反應程序如下：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，共循環40次。所有處理均做3次重復，采用2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers in Real-time fluorescent quantitative PCR

2 結果與分析

2.1 三個大豆Dof基因的生物信息學分析

在大豆轉錄因子數據庫PlantTFDB中共發現97條編碼Dof轉錄因子蛋白的mRNA序列，選取序列相似性較低的GmDof2.1(GenBank登錄號：XM003539689)、GmDof3.1(GenBank登錄號：XM003543559)和GmDof4.6(GenBank登錄號：XM006606352)進行后續分析。將3個大豆Dof基因編碼蛋白序列輸入NCBI數據庫與其他物種的Dof蛋白進行同源性比對，發現GmDof2.1與赤豆VaDof2.1具有較高同源性(85.06%)，GmDof3.1與木豆CcDof3.1具有較高同源性(79.45%)，GmDof4.6與木豆CcDof4.6具有較高的同源性(78.9%)。且它們都具有1個保守的Dof結構域(圖1)。

下劃線代表Dof結構域。GenBank登錄號：GmDof2.1.XP003539737；GmDof3.1.XP003543607； GmDof4.6.XP006606415； CcDof3.1.XP020223973；CcDof4.6.XP020238897;VaDof2.1.XP017431457。 The Dof domain was underlined. GenBank accession number:GmDof2.1.XP003539737; GmDof3.1.XP003543607; GmDof4.6.XP006606415; CcDof3.1.XP020223973; CcDof4.6.XP020238897; VaDof2.1.XP017431457.

蛋白質生化屬性分析發現(表2)，3個大豆Dof基因分別位于12，13，20號染色體上，編碼的蛋白序列長度分別為305，212，301個氨基酸殘基，等電點分別為7.57，8.70，8.75。亞細胞定位預測結果顯示(表2)，3個Dof蛋白均定位于細胞核中。磷酸化位點預測分析顯示(表2)，3個Dof蛋白均含有不同數量的絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化位點，這些氨基酸可能在維持蛋白的空間結構、活性及信號轉導等方面發揮作用。

2.2 三個大豆Dof基因啟動子序列分析

在大豆基因組數據庫中搜索3個大豆Dof基因起始密碼子上游1 500 bp的啟動子序列。對啟動子序列中的順式作用元件進行預測分析。結果如表3所示，GmDof2.1啟動子序列中含有3種與逆境和激素響應相關的元件(ARE、DRE1和MBS)，GmDof3.1啟動子序列中含有6種與逆境和激素響應相關的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、TGACG-motif、W-box和WUN-motif)，GmDof4.6啟動子序列中含有7種與逆境和激素響應相關的元件(ABRE、ARE、CGTCA-motif、GARE-motif、MBS、TGACG-motif和WUN-motif)。此外3個Dof啟動子序列中還含有多種與光應答相關的元件。預測結果表明，3個大豆Dof基因均可能響應多種激素的誘導并廣泛參與大豆對多種脅迫的應答。

表2 三個大豆Dof蛋白的鑒定及特性Tab.2 Identification and feature of the three Dof proteins in soybean

表3 三個大豆Dof基因啟動子順式作用元件預測Tab.3 Prediction of cis-elements in the three Dof promoters in soybean

2.3 三個大豆Dof基因在非生物脅迫下表達

大豆幼苗經NaCl、PEG、低溫和高溫處理后，利用實時熒光定量PCR對3個大豆Dof基因的表達動態進行檢測。結果顯示(圖2)，高鹽處理后，GmDof2.1表達量先升高后低于對照，GmDof3.1和GmDof4.6表達量升高，分別在處理5，24 h達到最大值；干旱處理后結果與高鹽處理類似，GmDof2.1表達量先升高后低于對照，GmDof3.1和GmDof4.6表達量升高，均在處理2 h達到最大值；低溫處理后，GmDof2.1表達量先降低后升高，GmDof3.1和GmDof4.6表達量升高，分別在處理5，36 h達到最大值；高溫處理后，3個Dof基因的表達量均持續升高，均在處理10 h達到最大值，且GmDof3.1和GmDof4.6表達量升高幅度較其他處理明顯。由此推測3個Dof轉錄因子在大豆中均可不同程度的響應非生物脅迫。

圖2 三個Dof基因在高鹽(A)、干旱(B)、低溫(C)和高溫(D)處理下的表達Fig.2 Expression of the three Dof genes under high salt(A), drought(B), low temperature(C) and high temperature(D) treatments

2.4 三個大豆Dof基因在葉、根和莖中的表達

實時熒光定量PCR檢測結果顯示(圖3)，3個Dof基因在大豆葉、根和莖中均有表達，不具有組織特異性。其中GmDof2.1和GmDof3.1在大豆根中的表達量最高，GmDof4.6在大豆莖中的表達量最高。

圖3 三個Dof基因在大豆葉、根和莖中的表達Fig.3 Expression of the three Dof genes in leaf, root and stem in soybean

3 結論與討論

鹽堿、干旱、低溫和高溫等是作物生長過程中最常見的非生物脅迫，對作物的生長發育和產量影響很大。轉錄因子在植物應對非生物脅迫時調控機制復雜，并且同一家族不同轉錄因子成員之間對非生物脅迫也存在相互調控的關系[19-20]。關于Dof轉錄因子的抗逆機制，有研究表明，Dof基因能夠調控類黃酮的積累[21]，而有些Dof基因則能響應水楊酸信號[22]。類黃酮和水楊酸都能在植物抵御逆境時發揮作用，例如,糖基化的類黃酮能幫助植物抵御紫外線的傷害，而水楊酸在植物進行防御反應時則作為信號分子[23]。

本研究利用生物信息學方法，對3個大豆Dof轉錄因子的基因及蛋白結構、理化性質、啟動子中順式作用元件等進行預測，為系統研究大豆Dof基因的功能提供了信息及參考依據。3個Dof基因編碼的蛋白長度從212～305個氨基酸，變化較大，但它們都具有1個保守的Dof結構域，因此都屬于Dof基因家族成員。根據其蛋白長度變化較大，推測大豆中Dof基因的起源和進化模式比較復雜，基因在功能上可能具有多樣性。

基因在不同組織中的表達可能暗示該基因在相應表達部位的生物學功能。在禾本科植物水稻、玉米和小麥中，大部分Dof基因在各個組織或器官中都有不同程度的表達，但部分基因在某些組織和器官中具優勢表達特征，它們可能在植物生長發育的某一個或某幾個發育階段發揮特殊功能[24]。同樣，本試驗中的3個Dof基因在大豆葉、根和莖中的表達情況也不同，可能預示其功能存在多樣化。

研究表明，Dof轉錄因子作為轉錄激活子或抑制子可參與調節植物的防御反應[25]。在小麥的17個響應干旱脅迫的Dof基因中，除TaDof14和TaDof15的表達量明顯上調外，其余 15個均下調，表明多數小麥Dof基因可能負向調控植物的干旱適應性[12]。但在水稻的30個Dof基因中，僅有3個基因的表達在PEG處理后受到顯著抑制，而其他基因的表達則明顯上調，它們可能正向調控植物的干旱適應性[26]。本試驗對高鹽、干旱、低溫和高溫處理下3個大豆Dof基因的表達量進行了檢測。3個Dof基因的表達雖然總體趨勢相似，均有上調，但在響應時間和響應強度上存在差異。表明這3個大豆Dof基因均參與大豆對非生物脅迫的響應，但它們是否與植物的抗逆性相關，調控機制如何等問題仍有待進一步深入研究。