玉米大斑病菌StCHS6的基因結構及表達規律分析

畢歡歡，張曉雅，王小敏，劉玉衛，鞏校東， 谷守芹，韓建民，董金皋

(1.河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北 保定 071001；2.泊頭職業學院，河北 泊頭 062150)

玉米大斑病(Northern corn leaf blight)是一種常見的玉米葉部病害，在我國的東北、華北北部以及南方冷涼山區常有發生[1]。引起該病害的病原菌為玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)。該病害直接影響玉米葉片的光合作用從而導致玉米減產，嚴重時減產可達50%[2-3]，目前在生產上種植抗病玉米品種是最重要的防控措施，但近年來由于該病菌變異頻繁，使得抗病玉米品種的抗性頻頻喪失[4]。因此，研發新型殺真菌制劑已成為目前研究的熱點之一。

研究表明，真菌細胞壁是由糖蛋白、葡聚糖和幾丁質所構成，其中幾丁質在賦予細胞壁剛性、物理強度和特定形狀中發揮重要作用[5-6]。幾丁質是由膜蛋白幾丁質合成酶通過催化N-乙酰葡糖胺單體聚合形成[7]。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發現了3個編碼幾丁質合成酶的Scchs基因。Scchs1p在出芽過程中作為一種修復酶，修補酵母子細胞脫離母體后脆弱的細胞壁；Scchs2p參與初級隔膜的形成；Scchs3p參與芽痕和側壁的幾丁質合成[8-9]。在禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)中，FgChs2和其他的幾丁質合成酶基因共同調控病菌的營養發育和毒力[10]。在稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)中，MoCHS1、MoCHS6和MoCHS7對于植物侵染是必需的，MoCHS5和MoCHS6在維持菌絲的極化生長過程中共同發揮作用[11]。另外，對釀酒酵母(S.cerevisiae)、禾谷鐮刀菌(F.graminearum)、小巢狀麴菌(Aspergillusnidulans)、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)和稻瘟病菌(M.oryzae)等真菌進行系統進化分析表明，這些真菌中的幾丁質合成酶基因可為7類(Class Ⅰ～Class Ⅶ)[10]。河北省植物生理與分子病理學重點實驗室植物病原信號轉導課題組前期研究中在玉米大斑病菌中已鑒定得到8個幾丁質合成酶基因(StCHS1～StCHS8)，將這些幾丁質合成酶基因同樣分為7類(Ⅰ～Ⅶ)，其中StCHS7屬于Class Ⅰ,StCHS8屬于Class Ⅱ,StCHS6屬于Class Ⅲ,StCHS2屬于Class Ⅳ,StCHS5屬于Class Ⅴ,StCHS1屬于Class Ⅵ，StCHS3、StCHS4屬于Class Ⅶ。

本研究擬從玉米大斑病菌中克隆其關鍵的幾丁質合成酶基因StCHS6(Class Ⅲ)，并利用SMART、GSDS、Expasy、SOMPA和WoLF PSORT等軟件對其基因結構及其所編碼的蛋白進行分析，進一步利用RNA-Seq技術分析StCHS6在病菌不同發育時期的表達模式，旨在明確玉米大斑病菌幾丁質合酶基因StCHS6的結構特征及表達模式，闡明該基因在病菌的生長發育及致病過程中的作用及研發以幾丁質合成酶基因為靶標的新型抗真菌藥物奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

玉米大斑病菌1號小種菌株01-23，由河北農業大學河北省植物生理與分子病理學重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

dNTP Mixture、10×PCR Buffer、TaqDNA聚合酶及PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser均購于寶生物工程(大連)有限公司；便捷型植物RNA快速提取試劑盒購于天津華力科析科技有限公司；膠回收試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3 試驗方法

1.3.1 RNA的提取 玉米大斑病菌野生型菌株于25 ℃黑暗條件培養12 d后，收集病菌氣生菌絲。RNA提取方法參照便捷型植物RNA快速提取試劑盒說明書。

1.3.2 第一鏈cDNA的合成 以1.3.1提取的病菌總RNA為模板，參照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒使用說明書合成第一鏈cDNA，并將反轉錄產物保存于-20 ℃備用。

1.3.3 玉米大斑病菌StCHS6基因的克隆 對玉米大斑病菌中幾丁質合成酶的鑒定結果表明，StCHS6的蛋白ID為133408。利用該蛋白ID于玉米大斑病菌基因組數據庫(http://genome.jgi.doe.gov/Settu1/Settu1.home.html)中下載StCHS6的CDS序列[12-13]。利用Primer 5.0軟件設計引物CHS6-F/R用于StCHS6的CDS序列擴增(表1)。PCR反應體系為：模板cDNA(300 ng/μL) 1 μL，CHS6-F/R(10 μmol/L)各1 μL，TaKaRaTaqDNA聚合酶(5 U/μL) 0.25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L) 2 μL，10×PCR Buffer 2.5 μL，ddH2O 17.25 μL。PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，35個循環，72 ℃再延伸10 min。擴增產物于1%的瓊脂糖凝膠上進行檢測。

表1 基因克隆引物序列Tab.1 Primer sequences used in gene cloning

1.3.4StCHS6基因及編碼產物的生物信息學分析StCHS6基因的結構特征及其所編碼蛋白的保守結構域、理化性質、二級結構和亞細胞定位分析參考文獻[14]。

1.3.5 玉米大斑病菌不同發育時期材料的收集 病菌不同發育時期材料的收集方法參考文獻[14]。

1.3.6StCHS6在玉米大斑病菌不同發育時期的表達模式分析 基于已經獲得的玉米大斑病菌RNA-Seq數據庫，分析StCHS6在病菌菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘5個典型的發育時期的表達情況。

2 結果與分析

2.1 玉米大斑病菌StCHS6基因的克隆及結構分析

利用StCHS6的蛋白ID從玉米大斑病菌基因組數據庫進行搜索，結果表明其位于病菌基因組scaffold_1:2066293-2069876(-)的位置，基因全長為3 584 bp，CDS序列大小為2 703 bp。以玉米大斑病菌cDNA為模板，對StCHS6的CDS序列進行擴增，得到的PCR產物大小與預期相符(圖1)。對目的條帶進行回收測序，擴增產物序列與數據庫所下載序列一致，表明在該病菌中克隆得到了StCHS6的CDS序列。

利用Gene Structure Display Server (GSDS)在線軟件對StCHS6的基因結構進行分析，結果表明，StCHS6含有4個內含子，5個外顯子(圖2)。內含子相位通常用于分析基因結構的進化，0、1和2代表內含子在密碼子中的位置。0代表內含子位于第1個堿基之前，1代表內含子位于第1個堿基之后，2代表內含子位于第2個堿基之后[15]。根據2個相鄰內含子的組合是否引起移碼突變定義了兩類外顯子：不對稱外顯子和對稱外顯子[16]。本研究發現，StCHS6基因不含有0相位，2個相鄰內含子相位的組合分別為(1-2)，(2-2)和(2-1)，表明在StCHS6中不對稱外顯子和對稱外顯子均存在。

M.DNA Marker(100～5 000 bp); 1, 2.StCHS6基因擴增產物。 M.DNA Marker(100-5 000 bp); 1, 2.Amplification products of StCHS6.

圖2 StCHS6基因結構特征Fig.2 The structure characteristics of StCHS6 gene

2.2 玉米大斑病菌StCHS6蛋白的理化性質分析及亞細胞定位

利用Expasy在線軟件對StCHS6蛋白的理化性質進行分析，推測StCHS6蛋白的分子式為C4586H6985N1203O1309S30，編碼900個氨基酸殘基，分子質量為100.877 98 ku，等電點(PI)為8.36，表明StCHS6蛋白為堿性蛋白。該蛋白的脂肪指數為81.86，親水性平均值為-0.178，不穩定指數為36.94，屬于穩定型蛋白。利用SOMPA對StCHS6蛋白的二級結構進行預測，結果表明在該蛋白中，無規則卷曲(Random coil)占43.56%，α-螺旋(Alpha helix)占38.44%，延伸鏈(Extended strand)占13.44%，β-轉角(Beta turn)占4.56%。利用SMART對StCHS6的保守結構域進行分析，發現StCHS6包含幾丁質合酶催化結構域Chitin_synth_1(682-694aa)和多個跨膜結構域(圖3)。利用WoLF PSORT對該蛋白進行亞細胞定位分析，推測其位于細胞膜上。

藍色長方形代表跨膜結構域；粉色長方形代表幾丁質合酶催化結構域Chitin_synth_1。 The blue rectangle represents transmembrane region; The pink rectangle represents the chitin synthase catalytic domain Chitin_synth_1.

2.3 StCHS6在玉米大斑病菌不同發育時期的表達模式

基于RNA-Seq數據對StCHS6在菌絲、分生孢子、芽管、附著胞及侵入釘5個發育時期的表達模式進行分析。結果表明，StCHS6在以上5個發育時期均有表達，但其表達量有所差異(圖4)。以芽管時期的表達量為1，菌絲、分生孢子、附著胞和侵入釘時期的表達量分別為菌絲時期的3.80，4.97，3.40，2.60倍，說明StCHS6在分生孢子時期表達量最高，在芽管時期表達量最低。以上結果表明，StCHS6在玉米大斑病菌生長發育及侵染過程中均發揮作用，但在各個發育時期的重要程度有所不同。

不同小寫字母表示在0.05水平上差異顯著。 Different small letters indicate significant difference at the 0.05 level.

3 討論與結論

前人研究表明，真菌中的幾丁質合成酶在維持細胞完整性、菌絲生長和寄主侵染等過程中均發揮重要作用[17-18]。在小巢狀麴菌(A.nidulans)中，Class Ⅲ的幾丁質合成酶對于菌絲生長是必需的[19]；在禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中沒有獲得Fgchs3b(Class Ⅲ)的缺失突變體，表明該基因的缺失可能是致命的[20]；在稻瘟病菌(M.oryzae)中，Class Ⅲ中的幾丁質合成酶的缺失會導致超過90%的分生孢子形態異常[11]；而在灰葡萄孢菌(B.cinerea)中，Class Ⅲ幾丁質合成酶(Bcchs3a)的缺失導致病菌毒力顯著降低[21]；在構巢曲霉(Aspergillusnidulans)中，Class Ⅲ類幾丁質合成酶基因AnchsB在其整個發育過程中都表達，當AnchsB敲除后，出現了菌株生長速率減慢、不產孢子、菌絲尖端膨大和側壁異常等表型缺陷[22]。以上結果表明，真菌中ClassⅢ幾丁質合成酶通過影響細胞壁的合成從而對病菌的生長發育及侵染和致病過程造成影響。本研究中，RNA-Seq數據表明StCHS6在病菌生長發育的各個時期都表達，但在菌絲和分生孢子時期表達量較高，由此推測，StCHS6可能參與玉米大斑病菌的菌絲生長及產孢過程，但需要進一步通過創制StCHS6基因敲除突變體進行驗證。

前人研究表明，幾丁質是植物病原真菌細胞壁的特有組分，該物質不存在于植物細胞壁中，因此，研發以抑制或干擾病原真菌幾丁質合成酶合成或降低該酶活性的新型殺菌劑是目前植物病理學界研究的熱點之一[23]。本研究只是分析了玉米大斑病菌幾丁質合成酶家族中的1個關鍵基因StCHS6的表達模式，尚沒有對整個基因家族的表達規律及功能進行系統分析。因此，在后續研究中，應利用基因敲除和過表達技術，明確該基因在病菌致病性方面的功能，進一步通過比較突變體與野生型菌株對細胞壁類殺真菌制劑的敏感性，明確殺真菌制劑的作用機制，并篩選創制新型殺真菌制劑。

本研究通過克隆得到了玉米大斑病菌幾丁質合成酶基因StCHS6的CDS序列，發現該基因含有4個內含子，5個外顯子。對其所編碼的蛋白進行分析，發現該基因編碼900個氨基酸，屬于堿性穩定型蛋白。該蛋白含有幾丁質合成酶催化結構域Ⅰ和多個跨膜結構域，定位于細胞膜上。對StCHS6在病菌菌絲、分生孢子、芽管、附著胞和侵入釘時期的表達量分析表明，該基因在分生孢子時期表達量最高，在芽管時期表達量最低，說明StCHS6可能在分生孢子時期發揮重要作用。