miRNA與電離輻射防護(hù)功能食品研究進(jìn)展

魯吉珂,陳 培,曹娜娜,陳 晨,伊娟娟,郝利民

（1.鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南 鄭州 450001；2.軍事科學(xué)院軍需工程技術(shù)研究所,北京 100010）

電離輻射是能引起物質(zhì)電離的輻射總稱,可以通過直接或間接作用電離出物質(zhì)中的原子和分子[1-2]。隨著核能的發(fā)展和核技術(shù)在能源和醫(yī)療等領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用,電離輻射幾乎無處不在,如果使用或控制不當(dāng),可對人類健康帶來潛在的危害與風(fēng)險(xiǎn)。電離輻射對生物體的損害表現(xiàn)為生物體內(nèi)重要器官損傷以及相關(guān)調(diào)控系統(tǒng)紊亂[3-4],這也會(huì)導(dǎo)致機(jī)體造血功能、生殖系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等不同程度的損傷[5-6],甚至發(fā)生癌變[7],其損傷程度取決于輻射種類、劑量、時(shí)間及機(jī)體的敏感性[8]。

電離輻射主要來源于宇宙射線、環(huán)境中天然放射性核素和核能應(yīng)用中的人工電離輻射源等,其中人工電離輻射源在工業(yè)、醫(yī)學(xué)診療以及軍事作業(yè)中應(yīng)用非常廣泛,是輻射防護(hù)研究的重點(diǎn)[9]。在臨床上放射治療是利用電離輻射抑制或殺滅癌細(xì)胞的一種有效手段[10-12],已廣泛應(yīng)用于多種癌癥的治療[13-16],但對正常細(xì)胞的輻射損傷仍是限制其有效利用的關(guān)鍵因素。另一方面,輻射暴露人員長期在核輻射條件下工作和生活,易遭受低劑量慢性輻射。因此,如何有效防護(hù)這種慢性輻射,保障人員身體健康,具有重要的軍事價(jià)值和社會(huì)意義。

為了減少輻射對正常細(xì)胞及組織的不利影響,人們采取多種防護(hù)措施以保障作業(yè)人員的健康,如縮短輻射暴露時(shí)間、增大接觸距離、加強(qiáng)輻射屏蔽、積極使用個(gè)人防護(hù)裝備等[17]。美軍曾為作戰(zhàn)人員配發(fā)核輻射防護(hù)裝備,并開展了相應(yīng)的防護(hù)訓(xùn)練,而開發(fā)輻射防護(hù)劑是減輕人體電離輻射損傷的有效便捷手段之一。

輻射防護(hù)劑是應(yīng)用于輻照前后來保護(hù)機(jī)體免受輻射損傷的一類功能性制劑[18],其研究開發(fā)已成為當(dāng)今醫(yī)療衛(wèi)生、軍事、能源等領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)之一。目前,已經(jīng)開發(fā)的輻射防護(hù)制劑以藥物為主,如含硫化合物、細(xì)胞因子和激素等[8],但其成本較高,且有一定毒副作用,常用于高劑量急性放射病治療。與之相比,富含天然輻射防護(hù)功能因子的功能食品通過飲食調(diào)理提高機(jī)體輻射耐受性,對于長期低劑量慢性輻射在效用和成本上具有特殊的優(yōu)勢。功能食品是供特定人群使用,不以治療疾病為目的,并且具有調(diào)節(jié)機(jī)體生理機(jī)能,有助于改善健康狀況或減少疾病發(fā)生的一類特殊食品。從天然產(chǎn)物或微生物代謝物中篩選制備具有電離輻射防護(hù)作用的功能食品基料,開發(fā)輻射防護(hù)功能食品,通過飲食調(diào)理提高機(jī)體輻射耐受性或降低輻射對機(jī)體的損害,是輻射防護(hù)的一條重要途徑。目前已經(jīng)報(bào)道的天然輻射防護(hù)劑,如黃酮類、多糖類、多酚類以及皂苷類等功能因子[19],能夠通過清除自由基,促進(jìn)DNA修復(fù)并調(diào)節(jié)凋亡信號通路,以減少輻射對人體造成的造血系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[20-23],其作用時(shí)效長,成本低且無明顯毒副作用[24-25]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate,EGCG）是綠茶中含量最高、活性最強(qiáng)的多酚類化合物,具有抗氧化、清除自由基和輻射防護(hù)等多種活性,以EGCG為主要組分的綠茶源食品一直是輻射防護(hù)食品開發(fā)的熱點(diǎn)[26-27]。

1 miRNAs、表觀遺傳和食品

1.1 miRNAs與表觀遺傳

MicroRNAs（miRNAs）是真核生物中廣泛存在的一類調(diào)控基因表達(dá)的內(nèi)源性非編碼RNA,其大小約為20～25 個(gè)核苷酸[28-29]。miRNAs主要通過堿基配對的方式與靶基因mRNA特異結(jié)合[30-31],從而調(diào)控轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)[32]。在人類等哺乳動(dòng)物中至少有1/3的基因受miRNAs調(diào)控,單個(gè)miRNA可調(diào)控?cái)?shù)十個(gè)基因[33]。miRNAs在基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工、細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育、遺傳和表觀遺傳等幾乎所有的重要生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,對miRNAs的鑒定及功能探索已成為當(dāng)前生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)和前沿。

表觀遺傳學(xué)是在不改變DNA序列的情況下,生物表現(xiàn)型發(fā)生改變,并保持相對穩(wěn)定和遺傳[34]。表觀遺傳學(xué)研究表明,環(huán)境在生物表型改變中發(fā)揮重要作用,而電離輻射是一種重要的環(huán)境因子,也是表觀遺傳學(xué)研究的重要模型。近年來研究證實(shí),表觀遺傳和miRNAs間存在著一定的聯(lián)系,不僅miRNAs的表達(dá)受表觀遺傳學(xué)調(diào)控,而且miRNAs也可通過調(diào)節(jié)DNA甲基化或組蛋白修飾等途徑影響表觀遺傳[35]。

1.2 miRNAs與食品

食品攝入是生物體與外界進(jìn)行物質(zhì)、能量和信息交換的一種方式,特定的飲食和功能食品因子會(huì)影響miRNAs的表達(dá)。體外癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí),功能食品因子可以調(diào)控miRNAs表達(dá),從而發(fā)揮抑癌作用。目前,研究較多的功能食品因子主要為多酚類物質(zhì),如EGCG、姜黃素和異黃酮等[36]。Tsang等[37]采用miRNAs芯片技術(shù),對EGCG處理前后的人肝癌細(xì)胞中miRNAs差異表達(dá)進(jìn)行分析,其中13 條miRNAs表達(dá)上調(diào),48 條miRNAs表達(dá)下調(diào),并證實(shí)EGCG可通過上調(diào)miR-16誘導(dǎo)人肝癌細(xì)胞細(xì)胞凋亡。Sun等[38]對姜黃素處理人胰腺癌細(xì)胞的效果進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示姜黃素可通過上調(diào)miR-22和下調(diào)miR-199a抑制胰腺癌細(xì)胞增殖,其也可通過下調(diào)miR-186表達(dá)促進(jìn)人肺腺癌細(xì)胞凋亡[39]。Li Yiwei等[40]采用異黃酮處理胰腺癌細(xì)胞,可使miR-146a表達(dá)明顯上調(diào),從而抑制胰腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)類似,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)特定的飲食可調(diào)控miRNAs表達(dá)。Tryndyak等[41]以大鼠為對象的研究發(fā)現(xiàn),甲基不足的飲食可誘導(dǎo)肝癌的發(fā)生,同時(shí)也可誘導(dǎo)大鼠肝臟中miRNAs表達(dá)的顯著變化,包括miR-34a、miR-127、miR-200b和miR-16a。Cirera等[42]對一種哥廷根小型豬喂食高膽固醇飲食,并采用標(biāo)準(zhǔn)飲食作對照,結(jié)果高膽固醇組的體質(zhì)量、總膽固醇和高密度脂蛋白含量均顯著增高,而肝臟miR-122表達(dá)顯著降低。人體實(shí)驗(yàn)證實(shí),在葉酸缺陷的飲食條件下,miR-222表達(dá)顯著增強(qiáng),并且低葉酸吸收水平時(shí)人外周血中miRNAs表達(dá)水平可反映其營養(yǎng)狀況[43]。

1.3 食品與表觀遺傳

食品和功能食品因子對生物體和細(xì)胞的作用不僅局限于生物表型及miRNAs表達(dá)差異,更為重要的是,表觀遺傳學(xué)研究表明,作為遺傳與環(huán)境重要接口的食品,其對生物體的影響可能會(huì)傳遞至后一代甚至后幾代。Sen等[44]研究發(fā)現(xiàn),孕期母親肥胖可顯著增加子代大鼠出生后肥胖的風(fēng)險(xiǎn),而采用富含VA、VC、VE等抗氧化劑的高脂飲食喂飼雌性大鼠,與高脂飲食雌性大鼠對照組相比,子代大鼠的肥胖傾向顯著降低,表明抗氧化食品對生物體氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)具有傳代作用。Zhang Junlong等[45]研究證實(shí),雌性小鼠孕期和哺乳期高脂飲食對子代有長效影響,子代小鼠miRNAs表達(dá)發(fā)生顯著變化,有23 條miRNAs表達(dá)水平下調(diào)了1.5～4.9 倍,下調(diào)miRNAs主要有miR-709、miR-122、miR-192、miR-194、miR-26a、let-7a、let-7b、let-7c、miR-494和miR-483。類似地,雌性小鼠孕期和哺乳期高脂飲食可下調(diào)子代小鼠miR-122、上調(diào)miR-370表達(dá),通過調(diào)控miRNA和相關(guān)基因的表達(dá)影響子代早期脂代謝[46]。不僅如此,母親孕期飲食對子代影響具有性別特異性,Mao Jiude等[47]對孕期小鼠分別采用差異化含脂飲食,在孕期12.5 d提取胎盤RNA進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)飲食誘導(dǎo)基因差異表達(dá)具有性別特異性,營養(yǎng)變化時(shí)雌性胎盤基因表達(dá)差異比雄性胎盤更為敏感。

食品對后代的影響不僅來自于母親,也來自于父親。Ng等[48]的研究發(fā)現(xiàn),采用高脂飲食的雄性小鼠,在追蹤其雌性后代的健康時(shí),父代的高脂飲食會(huì)導(dǎo)致雌性子代β細(xì)胞功能紊亂,削弱子代葡萄糖和胰島素的平衡從而引起代謝疾病。除此之外,Carone等[49]的研究顯示,攝入低蛋白食物的雄性小鼠的子代,其肝臟中脂肪和膽固醇表達(dá)基因較多,心臟病的發(fā)病率增加,表明父代飲食會(huì)影響子代脂肪和膽固醇代謝途徑。

2 miRNAs與電離輻射

1993 年Ambros Victor博士首次在秀麗隱桿線蟲體內(nèi)發(fā)現(xiàn)miRNA,現(xiàn)已證實(shí)miRNAs作為調(diào)控分子參與了幾乎所有的生物學(xué)過程[50],在細(xì)胞增殖、分化、凋亡過程中占據(jù)著重要的生物學(xué)地位[51]。腫瘤學(xué)研究表明,miRNAs功能失調(diào)與多種惡性腫瘤密切相關(guān)[32],不同腫瘤對應(yīng)的miRNAs可發(fā)揮致癌基因或抑癌基因的作用[52]。電離輻射是多種腫瘤尤其是白血病和淋巴癌的重要致癌因素,但其致癌機(jī)制目前尚不清楚。輻射誘導(dǎo)小鼠胸腺淋巴瘤模型表明,輻射致癌是一個(gè)多因素調(diào)節(jié)的多步驟復(fù)雜過程,包括致癌基因Ras、抑癌基因PTEN和抑癌基因p53,基因調(diào)控分子miRNAs也發(fā)揮重要作用[53]。Liu Cong等[53]對miRNAs在輻射致癌中的作用進(jìn)行了探究,采用輻射誘導(dǎo)的小鼠淋巴瘤模型,結(jié)果顯示輻射致癌胸腺組織中miR-21表達(dá)上調(diào)、抑癌基因Big-h3表達(dá)下調(diào),miR-21可以特異性靶向小鼠抑癌基因Big-h3并抑制其表達(dá)。Josson等[54]對miRNAs在前列腺癌細(xì)胞輻射處理中的調(diào)控作用進(jìn)行了研究,篩選出兩條顯著差異表達(dá)的miRNAs、miR-521和miR-34c,結(jié)果表明miRNAs可通過調(diào)控DNA修復(fù)蛋白的表達(dá),提高前列腺癌細(xì)胞的輻射敏感性。不僅如此,miRNA的表達(dá)也會(huì)影響電離輻射敏感性。miR-101的過表達(dá)抑制了鼻咽癌細(xì)胞增殖,增強(qiáng)了鼻咽癌細(xì)胞的放射敏感性[55],miR-15a/16通過靶向TLR1/NF-κB信號增強(qiáng)了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的輻射敏感性[56]。另外,miR-30在小鼠血清中以輻射劑量依賴性方式上調(diào),在輻射誘導(dǎo)的凋亡中起關(guān)鍵作用[57]。由此可見,miRNAs在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞的輻射處理過程中發(fā)揮重要作用。

本課題組前期通過高通量測序技術(shù)對4 Gy60Coγ輻射后小鼠組織中差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行篩選,結(jié)果表明在小鼠胸腺中共發(fā)現(xiàn)112 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（45 個(gè)已知miRNAs及67 個(gè)新的miRNAs）[58]；同時(shí),在小鼠肝臟中共發(fā)現(xiàn)48 個(gè)差異表達(dá)的miRNAs（27 個(gè)已知miRNAs及21 個(gè)新的miRNAs）[59]；其中miR-34a顯著上調(diào),這與文獻(xiàn)[59]報(bào)道結(jié)果一致。近年來,miR-34a與輻射的關(guān)系備受關(guān)注[60-61]。在正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中,輻射可上調(diào)miR-34a并通過調(diào)節(jié)下游分子機(jī)制誘導(dǎo)凋亡[62-63]。甚至有研究表明,miR-34a可作為機(jī)體輻射損傷標(biāo)志物[64-65]。因此,miR-34a可能是探索輻射防護(hù)作用機(jī)制的一個(gè)重要調(diào)控分子。

3 電離輻射與miR-34a信號通路

沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator 1,Sirt1）是已經(jīng)證實(shí)的miR-34a靶基因之一[66-67],在生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[68-70]。有研究表明,一氧化碳可以通過抑制miR-34a的表達(dá),從而促進(jìn)Sirt1的表達(dá)來保護(hù)肝臟免受缺血、灌注損傷[71]。Sirt1可通過去乙酰化過程調(diào)控其下游基因,如腫瘤抑制基因p53。Sirt1可使p53第382 位賴氨酸殘基去乙酰化而抑制p53活化[72-73]。而p53是核轉(zhuǎn)錄因子,在發(fā)生DNA損傷、活性氧、癌基因激活與缺氧等遺傳毒性應(yīng)激反應(yīng)時(shí),其可通過調(diào)控下游基因引起細(xì)胞周期阻滯,影響DNA修復(fù)、誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡[74-75]。p53可與miR-34a的CpG島啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生去甲基化反應(yīng),激活miR-34a的表達(dá),從而調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡[76-78]。因此,miR-34a、Sirt1、p53三者形成一個(gè)反饋調(diào)節(jié)回路,參與細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)控,這對于電離輻射防護(hù)調(diào)控機(jī)制研究非常重要。

由于miR-34a/Sirt1/p53信號通路與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),因此凋亡相關(guān)蛋白對于研究輻射防護(hù)調(diào)控機(jī)制也非常重要。目前研究比較清楚的執(zhí)行細(xì)胞凋亡的基因家族Bcl-2是由抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax組成,構(gòu)成了細(xì)胞死亡通路關(guān)鍵決定調(diào)控點(diǎn)。在細(xì)胞中,Bax被Bcl-2功能屏蔽。若Bax被活化,將發(fā)生一系列的構(gòu)象變化,使線粒體膜滲透性發(fā)生改變,促進(jìn)細(xì)胞色素c等促凋亡分子的分泌[79]。Caspase是凋亡通路的下游相關(guān)蛋白,而Caspase-3是Caspase家族中負(fù)責(zé)降解細(xì)胞基質(zhì)的重要效應(yīng)器。在應(yīng)激條件下,線粒體中釋放的細(xì)胞色素c激活Caspase-3,清除各種細(xì)胞基質(zhì),導(dǎo)致出現(xiàn)凋亡的形態(tài)特征,形成凋亡小體[80-81]。另外,Bcl-2家族被證實(shí)是p53作用的靶點(diǎn)之一,p53可調(diào)控抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄來抑制其功能,p53還可以與促凋亡蛋白Bax的啟動(dòng)子結(jié)合,激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑。因此,miR-34a/Sirt1/p53信號通路及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3在細(xì)胞增殖與凋亡中發(fā)揮重要作用,其對于研究輻射防護(hù)作用機(jī)制具有重要意義。

本課題組在體外研究中發(fā)現(xiàn),60Coγ輻射可激活正常肝細(xì)胞AML-12內(nèi)miR-34a/Sirt1/p53信號通路,上調(diào)miR-34a,下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2,上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表達(dá),最終導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生氧化損傷。采用功能食品因子EGCG預(yù)處理,可抑制miR-34a/Sirt1/p53信號通路,下調(diào)miR-34a,上調(diào)Bcl-2,下調(diào)Bax和Caspase-3的表達(dá),進(jìn)而發(fā)揮輻射防護(hù)功能[26]。因此,這個(gè)信號通路與天然產(chǎn)物的抗輻射機(jī)制密切相關(guān)。其后,本課題組又從免疫調(diào)節(jié)作用和抗氧化活性兩個(gè)方面對EGCG的體內(nèi)輻射防護(hù)作用進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)電離輻射能夠打破機(jī)體內(nèi)氧化還原系統(tǒng)平衡,進(jìn)而對小鼠正常組織造成嚴(yán)重?fù)p傷,采用EGCG灌胃30 d可以通過調(diào)節(jié)小鼠免疫活性及抗氧化活性而有效減輕輻射對小鼠脾臟及肝臟組織的損傷[27]。因此,EGCG是改善電離輻射損傷的一種有效的天然輻射防護(hù)劑,多酚類抗氧化劑具有良好的電離輻射防護(hù)功能。

4 結(jié) 語

輻射防護(hù)功能食品的開發(fā)與應(yīng)用,是保護(hù)電離輻射損傷的一條有效新途徑。在輻射環(huán)境、生物體和食品這三者的相互關(guān)系中,miRNAs作為調(diào)控分子可能發(fā)揮重要作用。生物體處于輻射應(yīng)激環(huán)境其miRNAs表達(dá)會(huì)發(fā)生變化,而攝入功能食品不僅可調(diào)控miRNAs表達(dá),而且這種調(diào)控可能具有傳代作用。miR-34a在電離輻射損傷和防護(hù)中發(fā)揮重要作用,電離輻射、輻射防護(hù)功能食品和miR-34a/Sirt1/p53信號通路密切相關(guān)。未來可進(jìn)一步探究天然產(chǎn)物的作用靶點(diǎn),并繼續(xù)對功能食品與環(huán)境因素相關(guān)的表觀遺傳學(xué)問題進(jìn)行深入研究。