牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體對食管癌細胞增殖遷移作用的研究

王浩潔，史 浩，齊義軍，朱夢璽，陳 攀，蘭子君，，張 灝，梁高峰，，高社干，

食管癌(esophageal cancer,EC)是常見的消化道腫瘤之一，全世界每年約有57.2萬人死于食管癌。中國是世界上食管癌高發地區之一，每年新增食管癌患者占全球一半以上，其中90%以上屬食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)[1-2]。由于早期食管癌缺乏典型癥狀及食管癌高危預警標志，5 a生存率較低(<25%)。研究表明：誘發食管癌的高危因素包括營養缺乏(經濟貧困)、攝入霉變食物或含亞硝酸鹽腌菜等因素。然而，隨著經濟和生活水平提高，我國食管癌的發病率依然較高，這提示其中還可能存在其它危險因素。

研究發現：約20%的惡性腫瘤與感染性因素相關，如幽門螺桿菌(Helicobacterpylori,HP)與胃癌[3]、人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)與宮頸癌[4]、具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum)與結腸癌[5]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是口腔關鍵致病菌之一[6]，并且大量的文獻報道了P.gingivalis感染與口腔癌、胰腺癌、老年癡呆等疾病的發生有一定關系[7-9]。此外，本課題組在之前也發現牙齦卟啉單胞菌感染可能是食管癌發生的一個高危因素[10-12]。還發現：ESCC組織中P.gingivalis含量明顯高于癌旁組織和正常食管黏膜組織，P.gingivalis含量與ESCC分化程度、淋巴結轉移和TNM分期呈正相關，與ESCC患者總體生存期呈負相關[13]。因此，P.gingivalis可能是ESCC發生發展過程中的重要參與者。然而，目前對P.gingivalis促進食管癌發生發展確切的分子機制尚不清楚。

越來越多的證據表明，腫瘤細胞來源的外泌體(exosome)被認為是腫瘤多階段演進中的關鍵因素[14-15]。作為一種直徑為30～150 nm的納米級別的胞外囊泡，外泌體通過攜帶多種生物活性成分介導細胞間的“物質和信息的交流”[16]，進而影響腫瘤進展的許多階段，包括血管生成、侵襲轉移和耐藥[17-19]。因此，探究牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體(P.gingivalis-Exo)對食管癌細胞的影響，對研究P.gingivalis促進食管癌發生發展，揭示其確切的分子機制有著十分重要的意義。本研究通過MTT、Transwell、劃痕和Western blot等實驗探究P.gingivalis-Exo如何通過TGF-β1/Smad2通路促進食管癌細胞增殖遷移。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器超速離心機(日立CP100WX，日本)；透射電鏡(JEM-2100，日本電子有限公司)；Zetasizer Nano(Malvern Panalytical，英國)；激光共聚焦顯微鏡(Nikon公司，日本)；全波長酶標儀(BioTek公司，美國)；蛋白電泳及轉膜系統(Bio-Rad公司，美國)；全自動化學發光成像系統(Tanon 5200，上海天能科技有限公司)；微量臺式高速離心機(Beckman Coulter，美國)；CO2培養箱(Thermo Fisher，美國)；厭氧培養箱(COY，美國)。

1.1.2 菌株及細胞P.gingivalisATCC 33277購自美國模式生物培養庫(American type culture collection，ATCC)；人食管癌細胞系(KYSE-150/KYSE-30)購自中國科學院細胞庫。

1.1.3 試劑Roswell Park Memorial Institute-1640培養基(RPMI-1640，Life Technologies公司，美國)；胎牛血清(FBS，Gibco公司，美國)；胰蛋白酶(南京維森特生物技術有限公司)；熒光染料DIR、DAPI(Sigma公司，美國)；四甲基偶氮唑鹽(MTT，Sigma公司，美國)；BCA蛋白濃度試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；Transwell小室(Corning公司，美國)；PVDF膜(Millipore公司，美國)；ECL發光液(上海天能科技有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)；一抗Smad2(CST公司，美國)；TGF-β1(Abcam公司，美國)；GAPDH(上海生工生物工程股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養P.gingivalis菌株ATCC 33277在含5%羊血、1%氯化血紅素和0.1%維生素K的GAM肉湯液體培養基中培養，放置37 ℃厭氧培養箱常規培養(85%N2、10%H2和5%CO2)。

1.2.2 細胞培養KYSE-150/KYSE-30在含有10%FBS，1%青鏈霉素的RPMI-1640中培養，放置于37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中常規培養。

1.2.3 外泌體提取收集P.gingivalis的培養上清液，加入50 mL離心管中，4 000×g離心30 min去除碎片。然后將上清液移入超離管中，超速離心100 000×g離心60 min，棄去上清液，最后用PBS緩沖液重懸沉淀，并用0.22 μm的針頭式過濾器進行過濾，分裝置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.4 電鏡鑒定P.gingivalis-Exo的結構P.gingivalis-Exo經無菌的PBS稀釋后，取20 μL的P.gingivalis-Exo懸液滴加于直徑2 mm載樣銅網上，濾紙吸去多余液體，室溫靜置3 min，于銅網上滴加3%磷鎢酸溶液約10 μL，負染5 min，在透射電子顯微鏡下觀察P.gingivalis-Exo并拍照。

1.2.5 Zetasizer Nano分析P.gingivalis-Exo粒徑使用Zetasizer Nano分析提取的P.gingivalis-Exo，將1 mL的P.gingivalis-Exo加入到比色皿中，上機，待其布朗運動1 min后，使用Zetasizer Nano軟件進行分析后計算出納米粒子濃度和尺寸分布。

1.2.6 細胞攝取P.gingivalis-Exo將1 μL濃度為5 mg·mL-1的DIR溶液加入到PBS重懸的P.gingivalis-Exo溶液中，37 ℃避光孵育30 min，100 000×g超速離心60 min，棄去游離的DIR染料，所得產物用PBS稀釋。

1.2.7 MTT實驗根據實驗分組，收集對數期的食管癌細胞消化、離心，用完全培養基重懸成單個細胞懸液，接種于96孔板中(每孔5×103細胞)，待其貼壁后加入P.gingivalis-Exo，每個樣設置5個復孔，放置在5%CO2、37 ℃的培養箱中孵育，分別在12、24、48、72 h后每孔加入15 μL的MTT(5 mg·mL-1)，繼續孵育。4 h后終止反應，棄上清液，加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min。用酶標儀在波長490 nm處測量OD值，并繪制生長曲線圖。

1.2.8 劃痕實驗將5×105個細胞接種于六孔板中，放置在5%CO2、37 ℃的恒溫培養箱中孵育。當細胞密度達到80%，在每個孔中心用100 μL槍頭尖端刮擦細胞，PBS洗滌3遍，并加入無血清的培養基和P.gingivalis-Exo進行共培養，然后分別在0、12、24 h進行拍照。通過Image J軟件確定無細胞區域。

1.2.9 Transwell實驗實驗前，先將50 mg·mL-1的基質凝膠稀釋(50 mg·mL-1的基質凝膠：PBS=1∶8)，并將其加入到24孔Transwell小室的上室，放置在5%CO2、37 ℃的培養箱中過夜使基質膠充分干燥。收集對數期的食管癌細胞，在無血清培養基中重懸，均勻混合。在Transwell上室中加入1×104個細胞，待其完全貼壁后加入P.gingivalis-Exo。最后，將500 μL含10%胎牛血清的培養基添加到下室。37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h后,棄去上、下室培養液，PBS洗滌，晾干，取出小室用4%多聚甲醛固定2 h，PBS洗3次，4 g·L-1結晶紫染色30 min，再用PBS清洗3次，Transwell小室在顯微鏡下觀察和拍攝。

1.2.10 Western Blot實驗將5×106個細胞接種于直徑為6 cm的培養皿中，KYSE-150/KYSE-30細胞與P.gingivalis-Exo共培養，37 ℃、5%CO2的恒溫細胞培養箱中孵育。24 h后，用預冷的PBS洗滌細胞3次，在細胞中加入300 μL RIPA裂解液(含3 μL的PMSF)，冰上充分裂解，14 000 r·min-1、4 ℃離心15 min，收集上清液。BCA試劑盒測定樣品蛋白濃度后，調整至一定濃度，放置-80 ℃備用。SDS-PAGE電泳：取100 μL的細胞裂解液加入25 μL的5×Loading buffer，100 ℃沸水浴加熱10 min 以充分變性蛋白。冷卻至室溫后，將蛋白樣品加入10%SDS-PAGE膠的上樣孔內，先80 V后120 V恒壓電泳，然后300 mA恒流轉印至PVDF膜上。轉膜完畢后，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入一抗GAPDH(1∶1 000)、Smad2(1∶1 000)、TGF-β1(1∶1 000)，4 ℃搖床過夜，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL顯色并拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1P.gingivalis-Exo的物理表征收集P.gingivalis的培養上清液，然后采用超速離心法提取外泌體。透射電子顯微鏡觀察P.gingivalis-Exo，如圖1所示，外泌體形狀如卵圓形或“碟形”的雙層的結構，大小均勻，直徑在100 nm左右(圖1A)。納米粒度儀分析顯示外泌體的粒徑主要分布在130 nm左右(圖1B)。

A：電鏡下觀察P. gingivalis-Exo的形態；B：Zetasizer Nano分析P. gingivalis-Exo粒徑分布。圖1 P. gingivalis-Exo的物理表征

2.2P.gingivalis-Exo進入食管癌細胞為進一步研究P.gingivalis-Exo對食管癌細胞的影響，采用共聚焦顯微鏡觀察KYSE-150/KYSE-30細胞對P.gingivalis-Exo的攝取情況。P.gingivalis-Exo與食管癌細胞共培養4 h后，拍照觀察。紅色熒光表示被DIR染色的外泌體，藍色熒光表示被DAPI染色的細胞核，合并為明場、紅色熒光、藍色熒光的疊加圖。結果顯示，大部分紅色熒光定位在食管癌細胞胞質中，說明P.gingivalis-Exo可以被食管癌細胞攝取。見圖2。

圖2 食管癌細胞對P. gingivalis-Exo的攝取

2.3P.gingivalis-Exo促進食管癌的增殖、遷移和侵襲MTT實驗常用于檢測細胞活力。MTT結果表明,與對照組相比，P.gingivalis-Exo共培養的食管癌細胞增殖能力顯著增加(P<0.05，圖3A)。采用Transwell法檢測P.gingivalis-Exo對食管癌細胞侵襲能力的影響。結果表明，與空白對照組相比，P.gingivalis-Exo共培養組侵襲數量較多(P<0.05，圖3B)。通過劃痕實驗評估了P.gingivalis-Exo對食管癌細胞遷移能力的影響，從圖3C可以看出，P.gingivalis-Exo處理后，細胞愈合率明顯加快(P<0.05)，說明P.gingivalis-Exo顯著提高了細胞的遷移能力。以上結果表明，P.gingivalis-Exo對食管癌的增殖、遷移和侵襲具有明顯的促進作用。

2.4P.gingivalis-Exo通過TGF-β1/Smad2通路調控食管癌的增殖、遷移Western blot結果如圖4所示，與空白對照組相比，P.gingivalis-Exo處理組的食管癌細胞TGF-β1、Smad2蛋白表達呈上升趨勢，這表明P.gingivalis-Exo對食管癌細胞惡性行為的調控可能與TGF-β1/Smad2通路有關。

3 討論

P.gingivalis是口腔關鍵致病菌之一，其含量異常增加能夠導致口腔微生態失衡[6]。口腔微生態失衡不僅能夠引起口腔部分組織破壞，還能夠通過異常免疫反應損傷遠處組織，造成人體多種疾病的發生和發展，如慢性牙周炎、呼吸系統疾病、心血管疾病、糖尿病及多種腫瘤等[20-21]。最近的研究表明，P.gingivalis與食管癌的發生有著密切的關系[22]。牙齦卟啉單胞菌存在于61%的食管鱗狀細胞癌組織中，其在癌旁組織中只有12%的患者能夠被檢測，但在正常人的食管組織中尚未發現[13]。這說明P.gingivalis在食管癌發生發展中扮演著重要的角色。然而，目前對P.gingivalis促進食管癌發生發展確切的分子機制尚不清楚。

A：MTT實驗；B：細胞侵襲實驗；C：細胞劃痕實驗。①P<0.05；②P<0.01。圖3 P. gingivalis-Exo對食管癌惡性生物學行為的影響

圖4 P. gingivalis-Exo通過TGF-β1/Smad2通路調控食管癌的增殖、遷移

腫瘤-微環境在腫瘤進展、轉移和治療耐藥中發揮重要作用。外泌體是一種能被大多數細胞分泌的直徑大約為30～150 nm的具有脂質雙層膜的微小膜泡。它在體內的傳遞具有廣泛性，是細胞與細胞間通訊的重要分子，能夠攜帶RNA、DNA、蛋白質以及其他信號分子參與細胞間的信號轉導。有研究表明，結核桿菌分泌的外泌體能夠誘導巨噬細胞釋放的促炎因子TNF-α、IL-10、IL-6表達上升，從而影響巨噬細胞的免疫功能[23]。在2017年，Jessica探究了P.gingivalis-OMV在炎性免疫細胞中的作用，發現P.gingivalis-OMV在體內可以募集免疫細胞，引發巨噬細胞中的TNFα、IL-1β和IL-8分泌，從而產生更強的免疫反應，導致多種疾病的發生[24]。本研究通過電鏡、粒徑等物理表征證明成功提取了牙齦卟啉單胞菌來源的外泌體，粒徑約為130 nm，形狀如典型的外泌體“圓碟”狀，這兩種儀器測得的粒徑差異可能是由于納米粒度儀測的是外泌體納米粒的水動力直徑，略大于電鏡的結果。采用共聚焦顯微鏡觀察到了DIR標記的外泌體可以進入細胞并通過MTT、Transwell、劃痕等體外實驗驗證了P.gingivalis-Exo對食管癌細胞的增殖、遷移具有顯著的促進作用。

轉化生長因子-β (TGF-β) 信號通路在生物體和胚胎發育過程中起著至關重要的作用。它們協調著許多細胞過程，包括細胞增殖、分化、遷移和侵襲等[25-26]。大量的文獻報道了TGF-β與腫瘤的發生進展有一定的關系，可以促進腫瘤生長和轉移[27-29]。其中TGF-β1/Smad信號通路是TGF發揮生物學效應的主要通路。Smads蛋白是目前所知的唯一的TGF-β受體的胞內激酶底物。研究已經證實Smad2是TGF-β/Smads通路中一個關鍵的分子[30-31]。為了進一步探究P.gingivalis-Exo對食管癌的作用機制，通過Western Blot實驗發現，與空白對照組相比，P.gingivalis-Exo處理后TGF-β1、Smad2蛋白表達明顯上升，這說明P.gingivalis-Exo可能通過調控TGF-β1/Smad2通路來促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本文首次以P.gingivalis-Exo為對象，探討了P.gingivalis-Exo對食管癌細胞惡性行為的調控。通過MTT、Transwell、劃痕和Western blot實驗驗證了P.gingivalis-Exo在體外促進食管癌細胞增殖、遷移和侵襲，并初步探究了P.gingivalis-Exo對食管癌的影響機制，這些發現為治療食管癌提供了一個新的思路，但是P.gingivalis-Exo對食管癌調控的具體分子機制還有待深入研究。