非對稱軸向卟啉光敏劑的合成及其光動力學性質表征

王思宇，常晶晶，李艷輝，李艷偉，段潛，3

（1.長春理工大學 化學與環境工程學院，長春 130022；2.長春理工大學 材料科學與工程學院，長春 130022；3.教育部光電功能材料工程研究中心，長春 130022）

自癌癥［1］被發現以來，它就成為了嚴重威脅人類健康的頭號殺手之一。光動力學療法（Photodynamic therapy，PDT）［2-5］是上世紀80年代發展起來的治療腫瘤的新方法，在治療惡性方面區別腫瘤于手術、化療、放療等傳統治療手段［6-7］，具有選擇性高、療效確切［8］、微創及適應性好［9］、毒性低［10］、可姑息治療和可保護容貌及重要器官等［11］優點。光動力療法的作用機制［12-14］是利用光化學原理，將光敏劑藥物注射到患者體內，使光敏劑能夠在體內隨著血液循環分布于腫瘤部位，在一定波長的激發光照射下，光敏劑藥物因吸收大量光能從而被激發產生較高的能量，并將這些能量傳遞給腫瘤部位的氧使其變成活性較高的單線態氧及一些活潑的自由基，這些產物與生物大分子發生作用，破壞細胞和細胞器的結構與功能，從而殺傷腫瘤細胞，達到治療癌癥的目的。光動力學療法在臨床應用上所采用的光敏劑多為卟啉類化合物［15-16］，卟啉是一類具有大環共軛特殊結構和獨特性能的化合物。我國最早在1983年就已經成功研制了第一代光敏劑—癌光啉［17-20］，這是世界上第一種被闡明了確切化學結構的卟啉類光敏劑。第一代光敏劑有紅外區吸收系數低、對皮膚穿透性不好并伴有光敏反應和代謝慢等的缺點。因此在其后的研究中，以克服第一代光敏劑這些缺點為基礎開發了包括5-氨基酮戊酸［21］、間-四羥基苯基二氫卟酚［22］、初卟啉錫［23］、亞甲基蘭及亞甲苯蘭［24］、苯卟啉衍生物［25］和內源性卟啉［26］等第二代光敏劑［27-31］。我國在第二代光敏劑的研究中也取得了長足進展，上海第二軍醫大學研制的血卟啉單甲醚［32］對腫瘤的殺傷效果與苯卟啉衍生物單環酸A［33］相類似，血卟啉單甲醚目前已成功用于治療鮮紅斑痣［34］且已經獲批上市。但這類光敏劑也具有一定的缺點，如水溶性差、顏色深、易聚集而發生自猝滅從而使熒光和單態氧的產生同時減少、有一定的細胞毒性、靶向性低。另外，帶有正電荷的卟啉分子在進入血液循環時，較容易被網狀內皮系統吞噬，大大降低了腫瘤組織的分子數。本研究擬以卟啉為研究對象進行新型第三代光敏劑［35］的合成，制備化學結構明確、理化性質穩定、水溶液分散好、靶組織選擇性高、毒副作用低的光敏劑。這種新型光敏劑的治愈率會超過傳統的治療方法，并更大程度減輕癌癥患者的的痛苦。同時，這種高效且毒副作用低的抗癌藥物，將具有廣闊的應用前景和巨大的開發價值。

1 實驗

1.1 儀器和試劑

電子天平、磁力攪拌器、電熱真空干燥箱、磁力加熱攪拌器、恒溫水（油）浴鍋、旋轉蒸發儀、普通白光光源、自制特定波長LED光源設備、樣品的紫外光譜是日本SHIMADZU公司UV-1240型紫外-可見分光光度計測得；紅外光譜是日本SHIMADZU公司FTIR-8400s型傅里葉變換紅外光譜儀測得；核磁1H-NMR譜是美國Varian公司JEOL JNMA400型核磁共振儀測得。

對羥基苯甲醛、聚乙二醇、苯甲醛、吡咯、丙酸、無水硫酸鎂、無水乙醚、二氯甲烷、二甲基亞砜、甲醇、丙酮、二環己基碳二亞胺、石油醚、N，N-二甲基甲酰胺、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、3，3′-二硫代二丙酸、透析袋、4-二甲氨基吡啶用于反應，從國藥集團公司購買，其中吡咯在使用前為了除阻聚劑進行重新蒸餾，液體顏色由淡黃色變成無色透明狀態為止，實驗中提到的其它試劑均未經其它處理可直接使用。

1.2 單羥基苯基卟啉（TPP-OH）的合成

如圖1所示，將80 mL丙酸加入到三口瓶中，接回流裝置，加熱使丙酸沸騰，加入3.05 g（25 mmol）對羥基苯甲醛和7.70 mL（75 mmol）苯甲醛，攪拌至溶解，然后用恒壓滴定漏斗緩慢滴加6.80 mL（100 mmol）新蒸吡咯和20 mL丙酸的混合物，在10 min之內滴加完畢，在微沸下繼續回流1小時，停止加熱，冷卻到80℃左右時，加入60 mL無水乙醇，冷卻過夜，過濾得到紫色固體，用二氯甲烷作展開劑，收集層析柱色譜第二條色帶。濃縮后用氯仿和石油醚重結晶，產物產率為31.3%。

圖1 TPP-OH的合成路線

1.3 單羥基苯基卟啉接6-氯-1-己醇（TPPC6-OH）

如圖2所示，將TPP-OH（0.63 g，1 mmol），6-氯-1-己醇（0.15 ml，1.15 mmol）和碳酸鉀（0.14 g，1 mmol）放入250 ml的單口瓶中，加入100 ml的N，N-二甲基甲酰胺后充分混合，接回流冷凝裝置后，將混合物保持在155℃下回流12 h后，停止反應，待反應物放冷至室溫，移取反應液倒入盛有1 000 ml去離子水的燒杯中，靜置過夜。將混合物抽濾后得到濾餅，將濾餅用二氯甲烷萃取，并用無水硫酸鎂濾過除水干燥。真空箱過夜后收集粗產物，將粗產物在硅膠柱上純化，二氯甲烷作洗脫液，收集第三條色帶。產率36.2%。

圖2 TPPC6-OH的合成路線

1.4 將TPPC6-OH配金屬錫（SnTPPC6-OH）

如圖3所示，將TPPC6-OH（0.2 g，0.3 mmol）、無水氯化亞錫（2.2 g，0.3×30 mmol）和50mL的N，N-二甲基甲酰胺加入到100 mL的兩口圓底燒瓶中，磁力攪拌加熱回流，待反應5 h后停止反應，磁力攪拌下將反應液冷卻至室溫，然后將濾液倒入含有1.0 L去離子水的燒杯中，靜置，過濾后得到濾餅。用350 mL二氯甲烷將濾餅溶解后，用去離子水連續萃取三次，用無水硫酸鎂固體除水干燥后，將液體轉移至旋轉蒸發瓶減壓蒸干，真空干燥后得到紫色固體。

圖3 SnTPPC6-OH的合成路線

1.5 二硫鍵改性的羧酸末端卟啉的合成（Sn-TP?PC6-S-S-COOH）

如圖4所示，將SnTPPC6-OH（1.34 g，2 mmol）、3，3'-二硫代二丙酸（0.84 g，4.00 mmol）和4-二甲氨基吡啶（0.25 g，2.00 mmol），在氮氣保護下溶于60 mL無水N，N-二甲基甲酰胺的密閉裝置中，將密閉裝置移入冰水浴中固定，待冷卻至0℃，然后緩慢滴加入5 mL N，N-二甲基甲酰胺與二環己基碳二亞胺（0.82 g，4 mmol）的混合物，將溶液在室溫下攪拌過夜。過濾混合物以除去二環己基脲，用飽和食鹽水和二氯甲烷洗滌混合物，用無水硫酸鈉干燥。通過蒸發除去二氯甲烷后，得到粗產物。將粗產物在硅膠柱上分離，產率為56.1%。

圖4 SnTPPC6-S-S-COOH的合成路線

1.6 將SnTPPC6-S-S-COOH與PEG偶聯形成（SnTPPC6-S-S-PEG）

如圖5所示，以聚乙二醇（Mn=2 000）為偶聯劑，經酯化反應合成兩親性的光敏劑SnTPPC6-S-S-PEG。將SnTPPC6-S-S-COOH（100 mg，0.023 mmol），1-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（8.8 mg，0.046 mmol）和N-羥基琥珀酰亞胺（5.2 mg，0.046 mmol）溶于25.0ml二甲基亞砜中，在30℃下攪拌2.5 h以活化SnTPPC6-S-S-COOH的羧基，然后將聚乙二醇（4.6 mg，0.023 mmol）溶于5 mL二甲基亞砜后逐滴滴加到SnTPPC6-S-S-COOH的混合體系中，保持混合物在40℃反應72 h。所得溶液用去離子水透析3天（MWCO=2.5 kDa）。最后，對SnTPPC6-S-S-PEG的水溶液冷凍干燥，得到棕紅色粉末。

圖5 SnTPPC6-S-S-PEG的合成路線

2 結果與表征

2.1 TPP-OH的表征

圖6為單羥基苯基卟啉的紫外-可見光譜圖，單羥基苯基卟啉有兩種類型的特征吸收帶，分別是電子從基態So躍遷至第二激發單重態S2產生的一個B帶和躍遷至第一激發單重態S1產生的四個較弱的Q帶。在TPP-OH的紫外光譜圖中，B帶即Soret帶，出現于413 nm處；Q帶分別出現于515 nm，550 nm，592 nm，645 nm處。

圖6 TPP-OH在CH2Cl2的紫外-可見光譜圖

圖7為TPP-OH紅外吸收光譜中，其中3 432 cm-1處為較強的羥基伸縮振動峰，3320 cm-1和964 cm-1處分別為為吡咯環上N-H的伸縮振動和面內彎曲振動峰，在1 172 cm-1處是羰基C-O的伸縮振動峰，而 1 602 cm-1，1 512 cm-1，1 441 cm-1，1 348 cm-1，1 069 cm-1，801 cm-1，730 cm-1和703 cm-1處為單羥基苯基卟啉環的骨架伸縮振動峰。

圖7 TPP-OH的紅外光譜圖

圖8為單羥基苯基卟啉的核磁氫譜圖，其中δ=8.84 ppm處為吡咯環上八個質子的化學位移，δ=8.22 ppm處為苯環上的鄰位氫質子峰，δ=8.05 ppm處對應為羥基所在苯環的鄰位質子峰，苯環上的間、對位質子峰出現在δ=7.76 ppm處，δ=7.23 ppm處為羥基所在苯環的間位氫質子峰，卟啉環內質子的化學位移約在δ=-2.79 ppm處，羥基上的質子峰出現在δ=5.29 ppm處。圖中峰面積與對應氫的個數成正比，由此可以推判出己經合成產物的結構與單羥基苯基卟啉相符。

圖8 TPP-OH的1H-NMR譜

2.2 TPPC6-OH的表征

圖9是TPPC6-OH的紫外光譜圖，單羥基苯基卟啉接6-氯-1-己醇有一個較強的B帶和四個較弱的Q帶。B帶出現于413 nm處，Q帶出現于515 nm，551 nm，590 nm，647 nm。

圖9 TPPC6-OH在CH2Cl2的紫外-可見光譜圖

圖10是TPPC6-OH的紅外光譜圖，單羥基苯基卟啉接6-氯-1-己醇后在3 318 cm-1處出現較強的羥基伸縮振動峰，2 933 cm-1和966 cm-1處分別為吡咯環上N-H的伸縮振動和面內彎曲振動峰，在1 173 cm-1處是羰基C-O的伸縮振動峰，而1 605 cm-1，1 509 cm-1，1 438 cm-1，1 352 cm-1，1 475 cm-1，800 cm-1，728 m-1和700 cm-1處為單羥基苯基卟啉環的骨架伸縮振動峰。

在TPPC6-OH的1H-NMR譜圖11中，δ=8.81 ppm處為吡咯環上八個質子的化學位移，δ=8.15 ppm處為苯環上的鄰位質子峰，δ=8.04 ppm處對應為羥基所在苯環的鄰位質子峰，苯環上的間、對位質子峰出現在δ=7.68 ppm處，δ=7.66 ppm處為羥基鏈所連接苯環的間位質子峰，羥基上的質子峰出現在δ=5.21 ppm處，羥基鏈上的質子峰分別出現在δ=4.16 ppm，δ=1.91 ppm，δ=1.57 ppm，δ=1.51 ppm，δ=1.20 ppm，卟啉環內質子的化學位移約在δ=-2.84 ppm處。圖中峰面積與對應氫的個數成正比。因此可以判斷出己經合成出了TPPC6-OH結構。

圖10 TPPC6-OH的紅外光譜圖

圖11 TPPC6-OH的1H-NMR譜圖

2.3 SnTPPC6-OH的表征

圖12為SnTPPC6-OH在DMF溶液中的紫外可見光譜圖，可以清楚地看出在563 nm和605 nm處分別出現兩個弱的連續吸收峰，可將其歸屬為Q帶吸收；在429 nm處有一個強吸收峰，可將其歸屬為B帶吸收。從其紫外光譜可看出：吸收峰最強的B帶紅移，且吸收峰的個數減少，是由于Sn4+配位到卟啉的空腔形成配合物后，由于其分子對稱性提高產生的光譜學變化。

圖12 SnTPPC6-OH在DMF中的紫外-可見光譜圖

圖13為SnTPPC6-OH的紅外光譜圖，3 428 cm-1處為較強的羥基伸縮振動峰3 057 cm-1和2 926 cm-1處的峰是卟啉環及吡咯環上C-H伸縮振動吸收峰，1 599 cm-1處的峰是C=C雙鍵的伸縮振動峰，1 437 cm-1和1 475 cm-1處的峰是卟啉環及吡咯環骨架振動吸收峰，751 cm-1和702 cm-1處的峰是苯環上C-H彎曲振動峰。與圖10中TPPC6-OH紅外圖譜比較可以看出，2 933 cm-1處卟吩環上N-H的特征吸收峰消失，表明金屬錫成功配位到卟啉中心。

圖13 SnTPPC6-OH的紅外光譜圖

圖14為SnTPPC6-OH的1H-NMR譜圖，其中δ=8.81 ppm處為吡咯環上八個質子的化學位移，δ=8.25 ppm處為苯環上的鄰位質子峰，δ=8.13 ppm處對應為羥基所在苯環的鄰位質子峰，苯環上的間、對位質子峰出現在δ=7.73 ppm處，δ=7.26 ppm處為羥基鏈所連接苯環的間位質子峰，羥基上的質子峰出現在δ=4.22 ppm處，羥基鏈上的質子峰分別出現在δ=3.62 ppm，δ=1.93 ppm，δ=1.60 ppm，δ=1.50 ppm，δ=1.19 ppm。圖中峰面積與對應氫的個數成正比，卟啉環內質子峰δ=-2.84 ppm處消失，因此可以判斷出己經合成出了SnTPPC6-OH結構。

圖14 SnTPPC6-OH的1H-NMR譜圖

2.4 SnTPPC6-S-S-COOH的表征

圖15為SnTPPC6-S-S-COOH在DMF溶液中的紫外可見光譜圖，可以清楚地看出在558 nm和599 nm處分別出現兩個弱的連續的Q帶吸收峰，在425 nm處有一個強B帶吸收峰。與圖12相比，圖譜形狀大體相似但B帶和Q帶均有一定程度的藍移且Q帶仍為兩個較弱的吸收峰。

圖15 SnTPP-S-S-COOH在DMF溶液中的紫外可見光譜圖

圖16為SnTPPC6-S-S-COOH的紅外光譜圖，1 745 cm-1為羧基的伸縮振動峰，1 728 cm-1是酯基的伸縮振動峰，3 022 cm-1和2 925 cm-1是卟啉環和吡咯環上C-H伸縮振動吸收峰，1 576 cm-1處的峰是C=C雙鍵的伸縮振動峰，1 439 cm-1和1 472 cm-1分別是吡咯環及卟啉環骨架振動吸收峰，756 cm-1和703 cm-1是苯環上=C-H彎曲振動峰。

圖16 SnTPP-S-S-COOH的紅外光譜圖

在SnTPPC6-S-S-COOH的核磁氫譜圖17中，δ=9.124 ppm為吡咯環上8個氫的化學位移，δ=8.245處為苯環上的鄰位質子峰，δ=8.148 ppm處對應為羥基所在苯環的鄰位氫質子峰，苯環上的間、對位氫質子峰出現在δ=7.74 ppm處，δ=7.26 ppm處為羥基鏈所連接苯環的間位質子峰，羥基上的質子峰出現在δ=4.22 ppm處，羥基鏈上的質子峰分別出現δ=3.63 ppm，δ=2.88 ppm，δ=2.77 ppm，δ=2.14 ppm，δ=1.6 ppm處。

圖17 SnTPP-S-S-COOH的1H-NMR譜圖

2.5 SnTPPC6-S-S-PEG的表征

圖18為SnTPPC6-S-S-PEG在DMF溶液中的紫外可見光譜圖，可以清楚地看出在562 nm和603 nm處分別出現兩個弱的連續的Q帶吸收峰，在428 nm處有一個強B帶吸收峰。與圖15相比，圖譜形狀相似但B帶和Q帶均有一定的紅移。

圖18 SnTPPC6-S-S-PEG在DMF中的紫外可見光譜圖

圖19為SnTPPC6-S-S-PEG的紅外光譜圖，與圖16相比，1 745 cm-1處羧基的伸縮振動峰消失，3 437 cm-1為末端-OH的伸縮振動峰；2 925 cm-1，2 848 cm-1和1 359 cm-1是卟啉環和吡咯環上C-H伸縮振動吸收峰；1 735 cm-1，1 243 cm-1，1 087 cm-1是酯基的伸縮振動峰；1 644 cm-1和1 456 cm-1是吡咯環及卟啉環骨架振動吸收峰，757 cm-1和799 cm-1是苯環上=C-H彎曲振動峰，說明SnTPPC6-SS-PEG已經合成。

圖19 SnTPPC6-S-S-PEG的紅外光譜圖

圖20為SnTPPC6-S-S-PEG的核磁氫譜圖，其中δ=9.137 ppm為吡咯環上8個氫的化學位移，δ=8.240 ppm處為苯環上的鄰位質子峰，δ=8.144 ppm處對應為長鏈上苯環的鄰位質子峰，苯環上的間、對位質子峰出現在δ=7.746 ppm處，e處δ=7.26 ppm處為-OH鏈所連接苯環的間位質子峰，δ=4.163 ppm，二硫鍵兩邊碳鏈上的質子峰分別出現δ=2.881 ppm，δ=2.799 ppm，δ=1.953 ppm，δ=0.810 ppm，所連接的聚乙二醇鏈的-CH2出現在δ=3.576 ppm處，末端H質子峰出現在δ=3.423 ppm處。

圖20 SnTPPC6-S-S-PEG在CDCl3中的核磁1H-NMR圖

SnTPPC6-S-S-PEG在水溶液中自組裝形成膠束，其外觀形貌可以通過掃描電子顯微鏡觀察，首先將SnTPPC6-S-S-PEG納米膠束用雙純水溶解，然后用移液槍將其緩慢滴加到預先處理硅片上，常溫下置于真空干燥箱中使其干燥過夜。次日取出保證干燥條件下將樣品噴金60 s后放入掃描電子顯微鏡樣品室進行掃描。

將一定量的SnTPPC6-S-S-PEG納米膠束溶液2 ml，經0.45 μm的水相濾膜過濾移入比色皿后，置于動態光散射儀凹槽中，將溫度設為37℃，待基線平穩后進行測試。

下圖21為掃描電鏡下的SnTPPC6-S-S-PEG納米膠束照片，用掃描電子顯微鏡測得膠束粒徑大小分別為98.4 nm，98.5 nm，98.7 nm及99.1 nm，粒徑大小分布均勻。

圖21 SnTPPC6-S-S-PEG納米膠束在掃描電鏡下的照片

通過動態光散射測試儀對溶液的粒徑進行測定。如圖22所示：動態光散射測得粒徑為81.59 nm和103.47 nm，其平均粒徑為91.33 nm。

圖22 SnTPPC6-S-S-PEG納米膠束的粒徑分布圖

2.6 SnTPPC6-S-S-PEG納米膠束的體外光動力學測試

2.6.1 納米膠束的單線態氧產生能力的測定

用白光作為光源，以1，3-二苯基異苯并呋喃作為捕獲劑，通過1，3-二苯基異苯并呋喃在415 nm處紫外吸收強度的變化來定性測試光敏性SnTPPC6-S-S-PEG產生單線態氧的能力。在室溫下，將1，3-二苯基異苯并呋喃溶于N，N-二甲基甲酰胺中配制成5×10-5mol/L的溶液，在N，N-二甲基甲酰胺溶液中加入一定量的TPP-OH，使TPP-OH的濃度為1×10-6mol/L，將其放在白光光照下，確定時間間隔為5 min，每次定量移取3 mL混合溶液于透明的石英比色皿中，測定SnTPPC6-S-S-PEG溶液在不同時間的紫外-可見吸收光譜。

以特定波長LED作為激發光源，用1，3-二苯基異苯并呋喃作為捕獲劑，通過1，3-二苯基異苯并呋喃在415 nm處紫外吸收強度的變化定性測試光敏劑SnTPPC6-S-S-PEG產生單線態氧的能力。在室溫下，先將1，3-二苯基異苯并呋喃溶于N，N-二甲基甲酰胺中配制成5×10-5mol/L的溶液，然后向該溶液中加入一定量的TPP-OH，使TPP-OH的濃度為1×10-6mol/L，將其放在430 nm，功率為3（mW/cm2）特定波長激發光下照射，每隔10 s，每次移取3 mL混合溶液于透明的石英比色皿中，分別測定SnTPPC6-S-S-PEG溶液和TPP-OH溶液在不同時間間隔的紫外-可見吸收光譜。

2.6.2 納米膠束的單線態氧產生能力的分析

如圖23和圖24所示：SnTPPC6-S-S-PEG在N，N-二甲基甲酰胺中降解1，3-二苯基異苯并呋喃的紫外-可見吸收光譜圖及其吸光度-時間關系曲線可以看出：0～45 min，SnTPPC6-S-S-PEG的斜率為0.017。吸收值與時間在0～45 min基本呈線性關系，說明SnTPPC6-S-S-PEG能夠持續穩定釋放出單線態氧。

圖23 SnTPPC6-S-S-PEG在DMF中降解DPBF的UV-vis吸收光譜

圖24 SnTPPC6-S-S-PEG在DMF中降解DPBF的時間相關吸收曲線

如圖25與圖26分別代表在N，N-二甲基甲酰胺中，TPP-OH和SnTPPC6-S-S-PEG在特定波長下降解1，3-二苯基異苯并呋喃的紫外-可見光譜圖，圖27是兩種化合物在特定波長下分別降解1，3-二苯基異苯并呋喃測定單線態氧產生能力的曲線，曲線的斜率代表單線態氧產生的速率，在0～100 s，SnTPPC6-S-S-PEG與TPP-OH的斜率均為0.012，兩者的吸收值與時間變化均呈線性關系，且最后產生的量相同，說明SnTPPC6-S-S-PEG具有持續穩定產生單線態氧的能力。

圖25 TPP-OH在特定波長下降解DPBF的UV-vis吸收曲線（DMF）

圖26 SnTPPC6-S-S-PEG在特定波長下降解DPBF的UV-vis吸收曲線（DMF）

圖27 TPP-OH與SnTPPC6-S-S-PEG在特定波長下降解DPBF的時間相關吸收曲線

3 結論

本文設計并成功合成了SnTPPC6-S-S-PEG這種新型結構的光敏劑，利用UV-vis、FT-IR、1HNMR對其結構進行表征，確定其結構已成功合成。掃描電鏡下的形貌和動態光散射下的平均粒徑為91.33nm且膠束顆粒分布非常均勻；通過對SnTPPC6-S-S-PEG納米膠束在白光條件以及特定波長激發光照射條件下產生單線態氧的能力進行測試，SnTPPC6-S-S-PEG在特定波長下不僅具有持續穩定產生單線態氧的能力，而且大大縮短了產生單線態氧的時間，具有良好的光動力學療法應用前景。