高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜法鑒別白酒中羧酸

廖勤儉，王小琴，周韓玲，安明哲，李楊華，郭 艷，宋廷富，羅 珠

（宜賓五糧液股份有限公司，四川宜賓 644007）

羧酸(Carboxylic Acid) 是白酒中常見的，也是最重要的一類有機(jī)酸。白酒釀造過程中產(chǎn)酸途徑很多，很多有機(jī)物都能通過化學(xué)反應(yīng)或微生物代謝生成有機(jī)酸，低級羧酸也可以逐步合成高級的羧酸，醇、醛等也可以氧化成羧酸。羧酸在白酒酒味協(xié)調(diào)中起著舉足輕重的作用，特別是高級脂肪酸對白酒后味的影響，同時羧酸也是白酒重要呈香組分羧酸酯的重要前體物質(zhì)。

白酒生產(chǎn)中關(guān)注較多的是酒體或釀酒過程中乳酸、乙酸、丁酸、己酸的比例及變化關(guān)系[1-2]，這與此前研究中主要以氣相色譜（GC）[3]或氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）[4]技術(shù)為主有關(guān)，高沸點(diǎn)的羧酸化合物難以氣化，即使使用酯化衍生處理后，有些羧酸也無法解析。采用高效液相色譜法[5-6]，離子色譜法[7-8]進(jìn)行有機(jī)酸的檢測，需要標(biāo)準(zhǔn)對照品對目標(biāo)物進(jìn)行定性定量分析，無法檢測白酒中未知的羧酸成分。夏季氣溫高，白酒生產(chǎn)企業(yè)普遍存在糟醅酸度高的問題，出窖糟醅中的羧酸隨著上甑蒸餾過程進(jìn)入酒體。為明確白酒中各羧酸對酒糟酸度、酒體酸度的貢獻(xiàn)，筆者利用高分辨的高效液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用檢測技術(shù)，根據(jù)羧酸化合物在目標(biāo)離子掃描模式下的裂解規(guī)律，無需對照品，較全面的分析了白酒中存在的有機(jī)羧酸化合物，特別是白酒中沸點(diǎn)較高的難揮發(fā)性羧酸。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇（MERCK,LC-MS級），超純水，白酒樣品（實(shí)驗(yàn)室自備）。

1.2 儀器與設(shè)備

美國Agilent公司1290系列高效液相色譜儀；(HPLC)-6520B系列質(zhì)譜檢測器（Q-TOF）；Agilent MassHunter數(shù)據(jù)采集工作軟件、定性分析軟件；Milli-Q超純水機(jī)（美國Mimpore公司）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18(2.1×100 mm 1.8-micron) ；柱溫：30 ℃；流速：0.2 mL/min；進(jìn)樣量：2 μL；流動相為甲醇B（液質(zhì)級）和超純水A（含0.1 g/L甲酸）；梯度洗脫條件：0～15 min：5%～100 % B，15.1～23 min：100 % B，23.1～25 min：5 %B，25 min：stop。

1.3.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源(DESI)；負(fù)離子模式掃描；離子源溫度為325 ℃；干燥氣流量為10 L/min；霧化器壓力為35 psig；碰撞電壓為60 V。

1.3.3 樣品前處理

白酒樣品10 mL，40 ℃真空濃縮，甲醇定容至2 mL，膜過濾后作為待測樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 羥基羧酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律

羥基羧酸的碳鏈上帶有一個-OH，即是羥基位于α位(與羧基碳原子直接相連的碳原子)，這一類羥基酸的-COOH相互影響較為活潑，還原性強(qiáng)，在一定的碰撞能量下，羧基碳原子與羥基碳原子之間斷裂，丟失-HCOOH，以α-羥基庚酸為例，其在15 V碰撞能量下的質(zhì)譜圖如圖1所示。同時以白酒中已知的丁二酸二乙酯為例，其在流動相中以-H替換一端的-C2H5，全掃描模式下呈現(xiàn)出的M/Z為145.0501，與α-羥基庚酸的M/Z相近，以此為母離子的二級質(zhì)譜圖詳見圖2，其碎片離子為99.0088也與α-羥基庚酸的碎片離子99.0818相近，高分辨率的檢測器仍能有效的辨別。

圖1 α-羥基庚酸二級質(zhì)譜圖

圖2 丁二酸二乙酯二級質(zhì)譜圖

2.2 二羧酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律

二羧酸的碳鏈上帶有兩個-COOH，通常處于分子末端，在一定的碰撞能量下，依次丟失-H2O和-COOH，以丙二酸和壬二酸為例，丙二酸在5 V碰撞能量下的質(zhì)譜圖見圖3，壬二酸在15 V碰撞能量下的質(zhì)譜圖如圖4所示。

圖3 丙二酸二級質(zhì)譜圖

圖4 壬二酸二級質(zhì)譜圖

2.3 芳香羧酸及雜環(huán)羧酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律

芳香羧酸，其羧基或位于芳香環(huán)上，如苯甲酸；或位于苯環(huán)上的碳支鏈末端，如苯乙酸。兩種情況下的羧酸質(zhì)譜裂解規(guī)律是一致的。在一定的碰撞能量下，丟失-COOH，以4-甲基苯甲酸為例，其在2 V碰撞能量下的質(zhì)譜圖如圖5所示。雜環(huán)羧酸質(zhì)譜裂解規(guī)律與芳香羧酸一致，丟失-COOH，以呋喃甲酸為例，其在5 V碰撞能量下的質(zhì)譜圖如圖6所示。

圖5 甲基苯甲酸二級質(zhì)譜圖

圖6 呋喃甲酸二級質(zhì)譜圖

2.4 一元羧酸的質(zhì)譜裂解規(guī)律

此處的一元羧酸為直鏈烷烴或支鏈烷烴末端接一羧基（COOH），以白酒中常見的正己酸、異己酸為例，其在不同碰撞能量下具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。正己酸和異己酸在20 V碰撞能量下的質(zhì)譜圖見圖7、圖8。

2.5 白酒中羧酸的質(zhì)譜分析結(jié)果

白酒樣品，按1.3.3進(jìn)行樣品前處理后，進(jìn)LCQTOF進(jìn)行檢測分析。以2.1、2.2、2.3、2.4的各類羧酸質(zhì)譜斷裂規(guī)律，根據(jù)白酒樣品一級質(zhì)譜掃描結(jié)果確定的分子式，目標(biāo)離子掃描模式下質(zhì)譜的碎片離子，定性解析樣品中的羧酸類化合物。樣品中的各化合物解析結(jié)果詳見表1。

圖7 正己酸二級質(zhì)譜圖

圖8 異己酸二級質(zhì)譜圖

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜四級桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，利用羧酸類化合物在目標(biāo)離子掃描模式下的裂解規(guī)律，解析出白酒樣品中的46種羧酸成分，其中包括5個α-羥基羧酸，3個雜環(huán)羧酸，4個芳香羧酸，3個二羧酸，5個酚酸，26個一元羧酸。

乙酸和丙酸屬于白酒中的常見羧酸，該方法側(cè)重于解析白酒中的未知高沸點(diǎn)羧酸。由表1可以看出，白酒中除去熟知的乙酸、丁酸、己酸、乳酸（α-羥基丙酸）外，還有一定含量的α-羥基丁酸、α-羥基戊酸、α-羥基己酸、α-羥基庚酸。白酒釀造及白酒酒體中α-羥基戊酸和α-羥基己酸的存在及變化情況，鮮有研究報(bào)道，其在酒體中形成的酯類化合物更是鮮見的。另外，白酒中也存在雜環(huán)羧酸和芳香羧酸，如檢出的呋喃甲酸、3-氧環(huán)丁羧酸、四氫-2-呋喃羧酸、苯甲酸、苯丙酸、甲基苯甲酸、羥基苯丙酸；白酒中還存在具有抗氧化活性的酚酸，如羥基苯甲酸、阿魏酸、香草酸、丁香酸、原兒茶酸；該方法能解析出白酒中研究較多的一元羧酸，從丁酸到硬脂酸，同時還發(fā)現(xiàn)不常見的不飽和烯酸，十四烷烯酸、十五烷烯酸、十六烷烯酸、十七烷烯酸、十九烷烯酸和二十烷烯酸。

表1 化合物的質(zhì)荷比、分子式、碰撞能量、碎片離子、斷裂方式和名稱

研究過程中發(fā)現(xiàn)，白酒中的二羧酸和α-羥基羧酸很容易與醇酯化反應(yīng)生成相應(yīng)的酯。如丁二酸在白酒中形成的丁二酸乙酯、丁二酸二乙酯。丁二酸乙酯的分子式C6H10O4，很容易誤認(rèn)為是己二酸，通過目標(biāo)離子掃描進(jìn)行二級質(zhì)譜碎片離子解析發(fā)現(xiàn)，其碎片特征離子為99.0048，丟失了C2H6O，所以該化合物應(yīng)是丁二酸乙酯，或是在流動相中-H替換一端的-C2H5的丁二酸二乙酯。另有全掃描模式下分子式為C7H12O4的化合物，也易認(rèn)為是庚二酸，而其碎片離子為乳酸和丁酸的特征離子89.0244和87.0457，丟失的是C4H7O2或C3H5O2，說明該化合物是乳酸與丁酸形成的酯。由此，該方法能有效的分辨白酒中相同分子式下的酸酯成分，解析白酒中的羧酸成分。