不同青稞品種與高粱中結合態風味成分和萜烯類物質的對比研究

車富紅，馮聲寶，李善文，黃和強，吳 群，陳 雙，王宇喬

（1.青海互助青稞酒股份有限公司，青海互助 810500；2.江南大學，江蘇無錫 214122）

青稞酒是以青稞為原料，經蒸煮、糖化、發酵、蒸餾、貯存、勾兌而成的中國傳統蒸餾酒。青稞酒被沈怡方先生高度評價為“高原明珠、酒林奇葩”。青稞酒中特有的糧香味主要來源于青稞原料，釀酒糧食對酒的風格有著不可或缺的作用，一是糧食中的成分（如淀粉）糖化后在微生物作用下發酵生成乙醇的同時會產生許多香味成分；二是糧食中的蛋白質、脂肪等成分在發酵過程中會分解成小分子化合物，成為酒體風味成分的前驅物（如氨基酸）或者本身就是風味成分；三是糧食本身帶來的風味成分，包括游離態和結合態風味成分[1]。糧食中游離態風味成分大部分為相對分子質量較低、沸點低、揮發性較強的化合物，高溫加工過程易造成揮發損失[2]。糧食中結合態風味成分本身是無風味的風味前體物質（通常是糖苷類化合物），在酸和堿的作用下釋放出來成為揮發性風味成分。原料中的風味化合物主要以結合態、不揮發性的、無氣味的風味前體物質存在并積累于植物中[3]。結合態風味化合物在植物原料中的含量為游離態風味化合物的2～5倍[4]。釀造糧食的結合態風味成分可能是影響白酒風格的潛在因素，在制曲、發酵和蒸餾等過程中，風味前體物質會分解、釋放出來[5]。曾有報道基于酸水解法研究了6種白酒釀造原料（高粱、大麥、糯米、玉米、大米、小麥）的結合態風味成分，一共檢出35種結合態風味化合物[6-7]。朱偉岸等[6]通過固相萃取和HS-SPME-GC-MS技術在高粱中檢出35種結合態風味化合物，其中包括4種醇類、10種醛酮類、4種芳香族、6種萜類、6種酸類、3種酯類和2種雜環類化合物。但目前對青稞原料中結合態風味物質的研究還未有報道。本研究采用全二維氣相色譜-飛行時間質譜技術（GC×GC-TOFMS）對不同青稞品種以及粳高粱中的結合態風味物質進行對比分析，對進一步解析以青稞為釀造原料的青稞酒風味獨特性具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

原料：黑老鴉青稞（產地：青海）、瓦藍青稞（產地：青海）、白浪散青稞（產地：青海），以上青稞品種均由青海互助青稞酒股份有限公司提供；粳高粱（產地：山東）江南大學提供。

試劑：氯化鈉、氯化鈣（分析純）；甲醇、乙醇、乙醚、正戊烷（色譜純）；超純水（實驗室用水均為煮沸并冷卻至室溫的超純水）；鹽酸、氫氧化鈉（分析純）；L-薄荷醇（內標）。

儀器設備：全二維氣相色譜-飛行時間質譜儀（GC×GC-TOFMS，配備Pegasus 4D工作站），美國LECCO公司；系統：GC×GC系統由安捷倫7890N氣相色譜和冷噴調制器KT-2001組成，本實驗采用液氮冷噴調制器；自動進樣器MPS2德國Gerstel公司；LC-C18固相萃取柱（2 g，10 mL），上海安譜試驗科技股份有限公司；Supelco固相萃取裝置（Visiprep DLSPG），美國Supelco公司，旋蒸儀、氮吹儀購于上海安譜科學儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 儀器條件

全二維氣相色譜-飛行時間質譜條件進樣口解析溫度250 ℃，解析時間5 min，進樣口溫度230 ℃；柱溫箱升溫程序：一維柱溫箱初始溫度40 ℃，保持0.5 min，以3 ℃/min升溫至70 ℃，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，保持25 min；二維柱溫箱初始溫度45 ℃，保持3 min，再以4 ℃/min升溫至150 ℃，保持2 min，再以6 ℃/min升溫至200 ℃，最后以10 ℃/min升溫至230 ℃，保持5 min；柱系統：采用60 m×0.25 mm ID×0.25 μm DB-FFAP為一維柱，1.5 m ×0.18 mm ID×0.2 μm Rxi-17為二維柱，兩根色譜柱通過毛細管柱連接器以串聯方式連接；調制器補償溫度：10 ℃；調制器設置：調至周期6 s（冷噴2 s，熱噴1 s），冷卻劑為液氮，熱調制氣體為壓縮空氣，冷調制氣體為氮氣；質譜條件：質譜檢測器為飛行時間質譜，EI離子源溫度200 ℃，電離電壓：-70 V，傳輸線溫度250 ℃，采用全掃描方式。

1.2.2 青稞原料中結合態風味前體物質的提取和分離

取15 g粉碎的青稞原料（過26目篩）于250 mL三角瓶中，加入75 mL色譜純乙醇，放置12 h，4 ℃冰浴超聲萃取30 min。離心（4 ℃，10000 r/min，15 min）取上清液。用75 mL色譜純甲醇按上述同樣的方法進行處理，最后將兩次處理的上清液進行合并，于40 ℃下旋轉蒸發去除有機溶劑，加入20 mL煮沸處理的超純水重新溶解，得前體溶液A。

1.2.3 青稞原料中結合態風味前體物質的純化

將前體溶液A用5 mL色譜純乙醚/戊烷（1∶1，v/v）萃取3次，以去除其中的游離態風味物質。采用固相萃取柱（SPE）法將得到的前體溶液進一步分離純化，加入20 mL煮沸處理的超純水重新溶解后，得到前體溶液B。

1.2.4 青稞原料中結合態風味物質的酸堿熱處理

用1 mol/L的稀鹽酸調節前體溶液B至pH1.0，沸水浴30 min，立即冷卻后再用1 mol/L的稀氫氧化鈉調節pH7.0，采用固相萃取柱（SPE）法將得到的前體溶液C進行自動進樣。

1.2.5 數據分析

所得數據經Pegasus 4D的工作站自動處理，定性所用的圖譜庫為NIST/EPA/NIH Version 2.0，所得數據再經進一步處理得到最終結果。定量方法采用內標法，進行半定量分析。

2 結果與分析

2.1 不同青稞品種與粳高粱中結合態風味成分的對比分析

全二維氣相色譜技術（GC×GC）是近年開發出的一種多維色譜分離技術，該技術將兩種分離機理不同的毛細管色譜柱通過一個調制器實現串聯結合形成二維氣相色譜系統對樣品進行分析。分析樣品通過第一維色譜柱分離后連續轉移至第二維色譜柱中進行再次分離。與常規一維氣相色譜比較，它具有分辨率高，靈敏度高，峰容量大等優點[8]。全二維氣相色譜與高靈敏度的飛行時間質譜（TOFMS）聯合使用，是實現復雜樣品揮發性組分分離鑒定的有力工具。目前GC×GC-TOFMS技術已經被用于多種酒精飲料揮發性組分的分析，是當前分析酒精飲料中揮發性組分最高效的技術手段[9-10]。本研究采用全二維氣相色譜-飛行時間質譜（GC-MSTOFMS）檢測原料中的結合態風味物質，將匹配度高且相似度大于700的化合物進行歸類整理，最終確定瓦藍青稞中含有344種物質，白浪散青稞中含有403種物質，黑老鴉青稞中含有352種物質，粳高粱中含有282種物質。而采用同樣的前處理方式，運用GC-MS對青稞中結合態風味物質進行分析，發現白浪散青稞中最終只鑒定出結合態風味物質127種、黑老鴉青稞中鑒定出126種、瓦藍青稞中鑒定出118種、粳高粱中鑒定出81種，遠少于采用GC×GC-TOFMS技術所鑒定出的風味成分種類數量。

通過將這些物質按照結構細分為13類，即醛類、醇類、酮類、酯類、呋喃類、萜烯類、芳香族類、酸類、苯酚類、吡嗪類、吡啶類、內酯類以及其他類。比較發現不同品種青稞中風味物質總含量差異顯著（圖1），風味物質總含量比較結果為白浪散青稞（355927.1 μg/kg）＞黑老鴉青稞（276753.9 μg/kg）＞粳高粱（123286.5 μg/kg）＞瓦藍青稞（116406.7 μg/kg）。

圖1 原料中風味物質總含量比較圖

從圖1可以看出，白浪散青稞和黑老鴉青稞中的醛類物質含量顯著高于粳高粱和瓦藍青稞（p≤0.05）。醛類物質在4種原料中含量最高，其次是醇類、酮類。李春揚等[11]研究表明，醛類化合物在4種原料中所占比例最大。本研究發現白浪散青稞中醛類含量最高，4種原料中含量最高的醛類主要有(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯甲醛、戊醛、庚醛、4-甲氧基-苯甲醛、壬醛、2,4-二甲基苯甲醛、(E)-2-庚烯醛、(反式)-4-壬烯醛、(Z)-6-壬烯醛、辛-2-烯醛、反-2-,順-6-壬二烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、乙醛、糠醛、2-甲基-2-丁烯醛、正己醛、巴豆醛；其中，正己醛在四種原料中含量最高，在3種不同品種青稞中均達到了25%以上，粳高粱中達到了63%，主要原因是青稞中風味成分豐富，醛類所占比重比較小，粳高粱中風味成分較少，所以醛類物質所占比重較大。醛類化合物具有強烈的香味，閾值較低，脂肪族低級醛有刺激性氣味，并隨碳鏈長度增加而增強，在C8—C12時香味強度達到最高值，隨著碳鏈增長，香味強度急劇下降，醛類的香味一般似果香，味甜帶澀[12]。

研究發現，醇類物質在黑老鴉青稞中的含量最高，主要有三甘醇、（E）3-辛烯-2-醇、2-辛烯-1-醇、1-辛烯-3-醇等，在黑老鴉青稞中占51%左右，瓦藍青稞中占31 %左右，白浪散青稞中占19 %左右，粳高粱中占25%左右。我們同時發現1-辛烯-3-醇在黑老鴉青稞原酒和瓦藍青稞原酒中含量比較高，白浪散青稞酒中次之，與原料中的含量趨勢一致。

酮類物質在白浪散青稞中含量最高，主要有2-庚酮、仲辛酮、1-戊烯-3-酮、3-辛烯-2-酮、2-丁酮等，在黑老鴉青稞中占35%左右，瓦藍青稞中占31%左右，白浪散青稞中占42%左右，粳高粱中占33%左右。原料中酯類非常少，其中辛酸乙酯、月桂酸乙酯、癸酸乙酯含量比較高，在青稞原酒中的含量也較高。

青稞原料中呋喃類化合物2-乙基呋喃含量最高、2-戊基呋喃（具有豆香、果香類似蔬菜香氣）次之。青稞原料中呋喃類化合物主要有2-乙基呋喃、2-正戊基呋喃、2-正丁基呋喃、2-甲基呋喃等，占呋喃類的70%左右，張曉磊等[12]研究表明，青稞中2-戊基呋喃最高，此數據與本研究結果有差異，可能與青稞的品種差異相關。

2.2 不同青稞品種及粳高粱中結合態風味成分的占比分析（表1）

表1 不同青稞原料中風味化合物占比 (%)

對4種原料中的風味成分進行占比分析，從表1可以看出，瓦藍青稞、白浪散青稞、黑老鴉青稞中醛類占總量的26 %～28 %、醇類占總量的12 %～18%、酮類占總量的12%～13%，而粳高粱中醛類物質占總量的44%，醇類占9%，酮類占11%，與青稞的風味成分占比有非常大的差異性，主要原因是青稞中微量成分種類比粳高粱中更多、更復雜。

本實驗室開展的天佑德青稞酒（主要以白浪散青稞和黑老鴉青稞為釀造原料）與部分以粳高粱為原料釀造的典型清香型白酒微量成分進行比較分析發現，天佑德青稞酒中的己醛、壬醛、苯甲醛、苯乙醛含量明顯高于以高粱為原料釀造的部分典型清香型白酒中的含量（數據未發表），青稞原料在前處理過程中也具有較明顯的醛類物質所具有的青草香，說明青稞酒中某些含量較高的醛類風味成分可能由青稞原料帶入。有文獻報道黃酒中的醛類物質以及部分受氧化作用影響的化合物會隨著黃酒的氧化而增加，這也與黃酒的陳香感有很大的相關性[13]，原料中的醛類物質是風味成分形成的前驅物，經過后期的發酵作用會生成更多的風味成分。

青稞原料中含有豐富的氨基酸，青稞原料在發酵過程中，通過氨基酸分解脫氨產生的雜醇油如正丁醇、正丙醇、異丁醇、異戊醇基本上都呈苦味，其中正丁醇、正丙醇的苦味較重，異丁醇極苦，異戊醇則是微帶甜苦[14]，適量的高級醇是青稞酒香味的主要組成成分，但當含量過高時，會給酒體帶來苦澀味。

酮類物質是白酒中的香味物質和助香物質，在白酒中的含量約占香味組分的2 %～3 %，雖然含量較少，其作用卻不可忽視。釀酒原料中的不飽和酮在發酵過程中會發生一系列反應，生成白酒中重要的香氣成分。但過于追求酮類物質也是不可取的，因其具有特殊氣味，過量會使酒質粗糙，口感不佳，香氣不協調。

研究還發現吡嗪類物質中2-甲基吡嗪，2,3,4,5-四甲基吡嗪在原料中含量最高，約為吡嗪類的90%。在酒醅研究中發現，四甲基吡嗪含量在發酵0 d、5 d時含量較高，隨著發酵時間的延長，四甲基吡嗪含量呈降低趨勢。在制曲過程中隨著培養時間延長四甲基吡嗪含量呈增長趨勢。

因青稞原料風味成分及營養成分比例存在差異，因此在青稞原酒口感方面也有一定的差異，如我們發現黑老鴉青稞釀造的原酒糧香突出；瓦藍青稞釀造的原酒具有水果香與花香；白浪散青稞釀造的原酒清香純正。

2.3 不同品種青稞與高粱中萜烯類物質的對比分析（表2）

白酒中的萜烯類化合物具有呈香或呈味作用，而原料中萜烯類物質也具有一定呈香呈味作用，除了單萜和少量的倍半萜具有氣味外，大部分萜烯類物質還呈現一定的苦味[15],另外，萜烯類物質一般都有一定的功能活性作用，如香芹酚的抗菌活性比麝香草酚要高[16]，肉桂醛可以抑制很多微生物生長，如細菌、霉菌[17]，α-蒎烯和檸檬烯在DPPH（1,1-二苯-2-三硝基苯肼）試驗時，具有較低的抗氧化活性，萜品烯和萜品油烯則顯示出較高的供氫能力，以對抗DPPH自由基[18]。因此，萜烯類物質一直是白酒中的熱門研究對象。

如圖2所示，萜烯類物質在黑老鴉青稞中檢出38種，相對含量23.9 mg/kg；白浪散青稞中檢出41種，相對含量21.1 mg/kg；瓦藍青稞中檢出39種，相對含量10.3 mg/kg；粳高粱中只檢出20種，相對含量55.8 mg/kg。青稞原料與粳高粱相比較，青稞中萜烯類物質種類更多、相對含量也更高。青稞入口具有一定的微苦味，很有可能是萜烯類物質含量較為豐富導致的。但青稞中的萜烯類物質含量高，種類豐富，也說明青稞相比高粱很可能具有更為優良的功能活性，這在很多科學研究中均得到佐證[19-21]。

分析發現，4種原料中都含有alpha-大馬酮，在黑老鴉青稞中含量最高，青稞中都含有反式芳樟醇氧化物（呋喃型），而粳高粱中未檢測到。黑老鴉青稞中二氫月桂烯醇、alpha-大馬酮、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、alpha-柏木烯、BETA-水芹烯、vitispirane等比其他3種原料相對含量都高。白浪散青稞中萜烯類物質相對含量也比瓦藍青稞、粳高粱高，如桉葉油醇、4-萜烯醇、α-松油醇、傘花烴、1,4-桉葉素、GAMMA-萜品烯（松油烯）等。瓦藍青稞中萜烯類物質總含量較低，粳高粱中萜烯類物質總含量最低。

研究還發現，香葉醇、（+）斯帕托烯醇、反式-4-檀香醇等是粳高粱中獨有的。而BETA-二氫紫羅蘭酮、beta-紫羅酮、橙花醇氧化物、反式芳樟醇化物（呋喃型）、桉葉油醇、1,4-桉葉素、杜松烯、BETA-水芹烯、萜品油烯、GAMMA-萜品烯、花側柏烯等萜烯類物質是青稞原料中所特有。

圖2 原料中萜烯類物質總含量比較圖

表2 4種原料中萜烯類物質分析結果 （μg/kg）

通過全二維分析檢測不同品種青稞釀造的天佑德青稞原酒，發現黑老鴉青稞原酒中含有46種萜烯類物質，瓦藍青稞原酒中含有44種萜烯類物質，白浪散青稞原酒中含有39種萜烯類物質。

3 結論

用全二維氣相色譜-飛行時間質譜（GC×GCTOFMS）檢測原料中的結合態風味物質，最終確定瓦藍青稞中含有344種物質，白浪散青稞中含有403種物質，黑老鴉青稞中含有352種物質，粳高粱中含有282種物質。青稞中的結合態風味物質及其相對含量均高于粳高粱，其中1-辛烯-3-醇在青稞原料中相對含量均高于粳高粱，同時發現其在黑老鴉青稞原酒和瓦藍青稞原酒中含量較高、白浪散青稞原酒中次之。辛酸乙酯在青稞原酒中也比較高，同時在青稞原料中相對含量也比較高。不同釀酒原料中萜烯類物質含量也有一定的差異，黑老鴉青稞含有38種萜烯類物質，白浪散青稞含有41種，瓦藍青稞含有39種，而粳高粱僅含有20種萜烯類物質。萜烯類物質既具有呈香或呈味作用，也具有一定的活性功能，不同品種的青稞中萜烯類物質含量更為豐富，這與文獻報道所揭示的青稞這一青藏高原地區獨特原料所具有的健康功能是一致。黑老鴉青稞原料中含有更為豐富的萜烯類物質如二氫月桂烯醇、alpha-大馬酮、4-氧代異佛爾酮、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、alpha-柏木烯、BETA-水芹烯、vitispirane等；其中，香茅醛、BETA-二氫紫羅蘭酮、beta-紫羅酮、玫瑰氧化物、橙花醇氧化物、反式芳樟醇氧化物（呋喃型）、桉葉油醇、1,4-桉葉素、杜松烯、BETA-水芹烯、萜品油烯、GAMMA-萜品烯、花側柏烯等萜烯類物質在3種青稞中都能檢測到，是青稞原料中獨有的；而香葉醇、香橙烯氧化物、（+）斯帕托烯醇、反式-4-檀香醇等是在粳高粱中獨有的。本研究首次闡明了不同青稞品種中的風味成分以及萜烯類物質的組成，發現了青稞相比高粱的獨特風味成分和萜烯類活性成分優勢，對揭示青稞與以青稞為原料釀造青稞酒的風味和健康相關性具有重要的參考意義。