釀造環境中細菌的篩選及代謝產物研究

張龍云，蒲 春，高 濤

(江蘇洋河酒廠股份有限公司，江蘇宿遷 223800)

白酒是以富含淀粉質的糧谷類為原料，以酒曲為糖化發酵劑，主要采用固態發酵，經蒸餾、貯存和勾調而成的含酒精的飲料[1]。白酒生產在中國具有悠久的歷史，一直深受人們的喜愛，且因原料種類和配比、酒曲種類和生產工藝以及自然環境等因素的不同，形成了不同特色不同香型的白酒[2]。結合白酒的生產工藝可以看出，微生物參與淀粉糖化、酒精發酵、產酯生香等生化過程，對于白酒風格的形成起到至關重要的作用[3]。白酒的生產是開放式多菌種共同發酵[4]，釀造環境對開放式的生產模式具有很重要的影響，尤其是空氣環境，整個白酒生產過程均與空氣接觸，而空氣中存在大量微生物孢子，空氣為釀酒微生物遷移運動提供了媒介，為白酒生產提供了大量不同種類的細菌、霉菌和酵母菌等。細菌在釀酒微生物群落中扮演重要角色，主要參與形成白酒復雜的風味和香氣[5]，尤其是對白酒中乳酸、乙酸、丁酸、己酸及其對應的乙酯以及α-聯酮化合物的生成有重大貢獻。本試驗從洋河酒廠釀造環境中篩選優勢細菌進行分離培養，通過形態學和生理生化方法進行初步分類鑒定，并對單株菌發酵培養后的代謝產物進行頂空氣相色譜分析，根據其發酵特性將其應用到芝麻香型白酒大曲生產中。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 研究對象

以洋河酒廠的2個一區釀酒車間和2個二區釀酒車間的釀造環境為研究對象，主要是場區釀酒車間窖池周圍空氣、工作環境空氣以及大曲、酒醅、窖泥、黃水、操作工具等。

1.1.2 試劑與儀器

試劑：葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、無機鹽、氫氧化鈉、氯化鈉等均購于國藥集團，為分析純；麩皮，市售；生化鑒定管購于青島海博生物技術有限公司。

儀器：PHS-3E臺式pH計，LDZH-200KBS立式滅菌鍋，DNP-9162A電熱恒溫培養箱，島津氣質聯用儀，HW-150C溫控振蕩培養箱，90-3恒溫雙向磁力攪拌器，SPME手動萃取裝置，Agilent GCMS/7890A-5975C聯用儀。

1.1.3 培養基

基礎培養基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏5 g，蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min。固體培養基加2%瓊脂。

麩皮固體培養基：麩皮100 g，加水70 mL，攪拌均勻后，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 空氣采樣

采樣方法為自然沉降法,分別在窖池周圍與工作環境選定5個采樣點，每個點做3個平行，將平皿暴露于空氣中5 min。采樣后37 ℃培養24 h，觀察記錄細菌的種類和數量。采用中華人民共和國國家標準確定的公共場所每立方米空氣中微生物總數的計算公式[6]計算空氣中細菌的濃度。

公式為：E=1000×50 N/At

式中：E為單位體積內空氣細菌數（cfu/m3）；

A為培養皿的面積(cm2)；

t為培養皿暴露時間(min)；

N為培養皿中細菌菌落數。

1.2.2 生產工具采樣

用無菌棉簽蘸取無菌水來回擦拭工具表面，放入取樣袋帶回。在實驗室無菌操作，將棉簽放入裝有約2 mL無菌水的小試管，振蕩使樣品溶于水中，取200 μL樣品溶液平板涂布。在37 ℃培養箱中培養24 h，觀察記錄細菌的種類和數量。

1.2.3 固形物及液體采樣

稱10 g樣品溶于90 mL無菌水的三角瓶中，120 r/min振蕩搖勻30 min，再用試管依次梯度稀釋后涂布平板，在37 ℃培養箱中培養24 h，觀察記錄細菌的種群和數量。

1.2.4 產香細菌的篩選

將斜面保存的細菌分別接種到裝液量300 mL和500 mL三角瓶肉湯培養基，置于37 ℃搖床培養24 h后，以10 %接種量接種于麩皮固態培養基1000 mL三角瓶中37 ℃固態培養6 d，以感官評定的方法對產香細菌進行初篩，重點篩選能產生醬香的細菌。

1.2.5 生理生化試驗

生理生化試驗原理和方法參照《伯杰細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》[7-8]。

1.2.6 頂空固相萃取條件

稱取0.5 g樣品，5 mL飽和氯化鈉于頂空瓶中。將頂空瓶置于50 ℃水浴中恒溫10 min（將水浴杯置于磁力攪拌器上），插入75 μm CAR/PDMS on PDMS萃取纖維頭頂空吸附30 min，于250 ℃解吸5 min后進行GC-MS分離鑒定。

氣相色譜條件：DB-WAX色譜柱(30m×0.25mm，0.25 μm)；載氣為He，流速1 mL/min；程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min升溫速率升至80 ℃，最后以10 ℃/min升至230 ℃/min保持7 min；汽化室溫度250 ℃；不分流[9]。

2 結果與分析

2.1 場區空氣細菌的分布特征

以洋河酒廠的2個一區釀酒車間和2個二區釀酒車間的釀造環境空氣為研究對象，利用自然沉降法采集場區釀酒車間窖池周圍空氣和工作環境空氣樣本，進行細菌適溫培養，并對細菌進行種類和菌體濃度統計。由圖1可知，一區環境空氣中細菌的菌體濃度明顯多于二區環境空氣中細菌的菌體濃度，工作場所環境空氣中細菌的菌體濃度明顯多于窖池環境空氣中細菌的菌體濃度，其中一區窖池環境空氣中細菌菌體濃度是二區窖池環境空氣中細菌菌體濃度的1.75倍，一區工作場所環境空氣中細菌菌體濃度是二區工作場所環境空氣中細菌菌體濃度的2.26倍，這是因為空氣中的細菌是白酒釀造微生物的重要來源之一,老產區窖池因發酵生產時間長，富集的細菌較多，因而窖池中細菌與周圍環境空氣遷移的較為頻繁，使老產區窖池環境空氣的細菌菌體濃度明顯高于二區窖池環境空氣中的細菌菌體濃度，同時工作場所是酒醅加曲前處理的場所，曲中細菌濃度遠遠超過空氣中細菌濃度，與空氣細菌進行交互，會提高空氣中細菌菌體濃度，且一區生產釀造時間更長，工人的操作使得空氣流動更快，最終結果是空氣中富集的細菌也更多，所以一區工作場所環境空氣中細菌菌體濃度顯著超過二區工作場所環境空氣中細菌濃度，工作場所環境空氣中細菌菌體濃度顯著高于窖池環境空氣中的細菌菌體濃度。由圖2可知，一區環境空氣中細菌種類比二區環境空氣中的細菌種類多，工作場所環境空氣中細菌種類比窖池環境空氣中的細菌種類多。主要原因是一區生產使用時間長，經過長時間的馴化和適應，更加利于細菌生長，使環境空氣中擁有更多的細菌種類；工作場所環境空氣比窖池環境空氣相對更開放，同時由于生產操作，它的流動性也更強，所以能富集更多種的細菌。白酒的生產是開放式多菌種共同發酵，與空氣接觸較多，空氣微生物會對發酵產生重要影響，空氣微生物數量和種類越豐富對白酒發酵生產越有利，從場區空氣細菌種類和菌體濃度上來看，一區微生物組成與結構更加豐富和穩定。環境中共提取到29株細菌，優勢菌菌落形態如圖3，從顯微鏡鏡檢的結果表明，環境空氣中芽孢桿菌占大多數。

2.2 產香風味細菌的篩選

在麩皮固體培養基上接種細菌種子液，37 ℃培養6 d，每天進行一次感官評定并記錄。隨著培養進行，陸續篩選出10株能在麩皮固體培養物產生醬香味較為明顯的細菌，以此作為下一步復篩的出發菌株。

圖1 不同功能區空氣細菌濃度分布特征

圖2 不同功能區空氣細菌種類分布特征

2.3 產香風味細菌的培養特征

菌株在基礎培養基上菌落特征見表1。其中，1#、7#和10#菌落形態相似，菌苔厚，呈乳脂狀；3#、6#和9#菌落形態相似，菌苔薄，略透明；2#、4#、5#和8#菌落形態相似，菌落邊緣呈絲毛狀不整齊，產生淡紅色色素。

顯微觀察菌株的細胞形態特征見表2。這10株菌都是芽孢桿菌，按菌體寬度大致可分為3個標準，圖4分別是具有代表性的1#、6#、10#細菌。

菌株的生理生化特征見表3。經16s rRNA鑒定，1#菌株為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；2#、5#、6#、8#、9#菌株為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）；3#菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus lichenifor-mis）；4#菌株為多粘類芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）；7#、10#菌株為環狀芽孢桿菌（Bacillus circu-lans）。

圖3 釀酒空氣中優勢菌落形態

表1 菌株的培養特征

表2 菌株的細胞形態特征

圖4 1#、6#、10#細菌形態

表3 菌株的生理生化特征

2.4 細菌固態發酵產物分析

圖5 代表菌株2#吡嗪類化合物氣相色譜圖

將10株細菌純種液態培養后，氣相色譜分析液態發酵產物。同時，接種于麩皮培養基中，利用頂空固相微萃取-氣質連用方法，分析10株細菌固態發酵產物。

經過分析可知，10株細菌定性到的化合物數量和種類都較多，既有相同的風味物質，又有獨特的風味化合物：10株細菌分別定性到20種、24種、27種、28種、28種、17種、27種、29種、38種、31種含量較多的風味化合物，其中9#菌產風味物數量最多；這些代謝風味化合物主要集中在吡嗪類化合物、芳香族化合物、醛類、酮類、多元醇、烯醇類、呋喃類化合物及其他雜環化合物等，還有少量的酸類、酯類、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物。其中吡嗪類化合物，主要有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,4-二甲基吡嗪、2,5-二甲基吡嗪、2，3，5-三甲基-6-乙基吡嗪、2-乙基-3，5-二甲基吡嗪、2-乙基-6-甲基吡嗪等，吡嗪類化合物蒸汽壓低、易揮發，且香勢強、香味閾值低，在食品中作為重要的風味物質。四甲基吡嗪是構成芝麻香和醬香風味的重要風味物質，可以為酒體提供充足的焙烤香氣和焦香味；并且定性到吡嗪類化合物的前體2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）等化合物，2,3-丁二醇在2#和7#菌株中定性到；3-羥基-2-丁酮/醋嗡在1#、3#、4#、6#、7#、8#、9# 7株菌中定性到，2,3-丁二醇和其他多元醇在酒中起助香作用，能增加口味綿、甜、柔軟、細膩感[10]，3-羥基-2-丁酮（醋酉翁）可以增加酒的悠長后味，嗜熱芽孢桿菌可以代謝這些物質形成吡嗪類化合物；芳香族化合物中苯酚、β-苯乙醇、愈創木酚（2-甲氧基苯酚）、4-乙烯基愈創木酚等含量較高。同時，運用內標法計算，進一步對幾種典型風味物質含量進行定量分析，結果如表4、圖6。

表4 功能性細菌典型風味化合物含量表

圖6 典型風味物質色譜圖

由表4可知，吡嗪類化合物中四甲基吡嗪和三甲基吡嗪在各菌株中產量相對豐富，四甲基吡嗪產量最高的是8#菌，達到了3.49（×10-10g/g），其次是5#菌3.08（×10-10g/g）其他菌種也檢測到，但含量相對較低；β-苯乙醇只在4#、5#、8#和10#中，并且含量相差不大；酚類物質主要是愈創木酚和4-乙烯基愈創木酚，愈創木酚產量最高的是2#菌4.51（×10-10g/g），其次是1#菌3.57（×10-10g/g），4-乙烯基愈創木酚產量最高的也是2#菌29.98（×10-10g/g）。β-苯乙醇具有濃郁的水果和蜂蜜的香氣，能夠賦予酒體自然發酵的香氣，愈創木酚、4-乙烯基愈創木酚則可以提供較多的堅果類香氣，賦予酒體成熟的焦香、醬香，可以賦予調味酒較多的醬香感。

通過本研究，初步確定了10株菌種液態和固態發酵產物。其中，有些風味物質如吡嗪類、多酚類等是芝麻香和醬香風味的重要風味物質，為酒體提供充足的焙烤香氣和焦香味，豐富了口感，為菌種進一步應用提供了參考。

3 結論

分析車間釀造環境中微生物，感官評定法篩選出10株產芝麻香細菌，形態學觀察、生理生化試驗、16s rDNA序列分析后，鑒定1#菌為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）；2#、5#、6#、8#、9#菌為凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans）；3#菌為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）；4#菌為多粘類芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）；7#、10#菌為環狀芽孢桿菌（Bacillus circulans）。通過氣相色譜分析液態發酵產物和頂空固相微萃取-氣質聯用分析固態產物，發現這10株產芝麻香細菌，代謝產物主要為吡嗪類化合物、芳香族化合物、醛類、酮類、多元醇、烯醇類、呋喃類化合物及其他雜環化合物等，還有少量的酸類、酯類、噻唑、噻吩、吡啶、吡咯化合物，其中代謝產物中有很多與芝麻香風味形成有關的化合物和其前體物質，有三甲基吡嗪、四甲基吡嗪、2,3-丁二醇、3-羥基-2-丁酮、β-苯乙醇、愈創木酚和4-乙烯基愈創木酚。此外芽孢桿菌在高溫制曲方面有很大的應用前景，在此基礎上，今后將對菌株的耐熱特性，產糖化酶、液化酶和蛋白水解酶活力，以及產特殊香味物質做進一步研究，以期應用于芝麻香高溫大曲的研制。