高效液相色譜-串聯質譜法測定酒類產品中13種甜味劑

王麗娟，柯潤輝，石 磊，安紅梅，楊春艷，陳嘉杰，吳奕萱

（1.青島大學環境科學與工程學院，山東青島 266071；2.中國食品發酵工業研究院有限公司，北京 100015）

甜味劑是一類重要的食品添加劑，能改善食品風味和口感，提高食品品質，尤其是人工甜味劑因成本低、甜度高、大多不參與代謝過程等優點成為蔗糖的代用品廣泛應用于現代食品工業[1-3]，但其可能存在的食品安全風險也一直備受爭議。因此，甜味劑的安全性和使用限量一直是各國政府和相關機構關注的熱點。我國《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》中規定了甜味劑的使用范圍和限量[4]。隨著食品工業的發展，復合甜味劑的使用和新型甜味劑的開發成為發展的潮流和趨勢，但這也對監管提出了新的挑戰。2008年11月，美國食品藥品管理局（FDA）批準瑞鮑迪苷A可以作為甜味劑應用到美國的食品和飲料中[5]。2014年5月，美國FDA批準高倍甜味劑愛德萬甜作為非營養甜味劑和增味劑用于除肉類及家禽之外的食品中[6]。隨后，歐盟和我國也相繼批準使用食品添加劑新品種愛德萬甜。考慮到人工甜味劑的使用所帶來的安全隱患，近年來“植物甜味劑”的產量和使用量持續增長。目前，國際市場上產業化和銷路最好的天然植物甜味劑為甘草甜素、甜菊糖（甜葉菊甙）和羅漢果甙[7]，并應用于食品工業，但鮮有此類甜味劑相關檢測方法的報道。酒類作為一個重要的日常消費品，其質量安全決定了消費安全。近年來，我國釀酒行業發展勢頭良好，生產技術水平和產品質量不斷提升，但也存在較多問題。由于經濟利益驅使，一些不法商販為掩蓋酒體苦、澀等不良口感，改善風味，出現在酒中違法添加非自生發酵產物的現象。根據國家食品安全監督抽檢結果，酒類產品中違法或過量添加甜味劑是其中一個突出問題，已成為監管重點，但仍有一些企業通過變換種類等方式逃避監管，將未納入監管范圍的一些新型甜味劑（包括植物甜味劑）作為替代品，謀取不正當利益。因此，建立快速、準確測定酒類產品中包含人工新型甜味劑和天然甜味劑在內的復合甜味劑的方法顯得非常必要。

近年來，國內外關于酒類產品中甜味劑的研究很多[8-10]，我國也建立了關于甜蜜素、糖精鈉、阿斯巴甜等傳統甜味劑檢測的國家標準[11-13]，但這些研究與標準多針對一種或幾種甜味劑，且大多為液相色譜法[14-16]，抗干擾能力較弱，易產生假陽性的情況，即使近幾年發布的行業標準[17]和相關文獻[1，18-19]，檢測種類也并不廣泛，對于批準使用的甜味劑新品種，鮮有文獻報道，僅可查到的幾篇也沒有針對酒類產品的檢測[6，20]，更沒有相關的檢測方法標準、產品使用限量指標等。本研究利用高效液相色譜-串聯質譜技術建立了酒類產品中13種人工及天然甜味劑的檢測方法，覆蓋了目前市場上商品化使用的人工甜味劑種類。本方法簡便、快速、靈敏，為酒類產品的生產和流通領域中甜味劑的監測提供了技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：白酒、葡萄酒、黃酒樣品，購自零售超市和商店。

儀器設備：LCMS-8050高效液相色譜-串聯質譜儀（日本Shimadzu公司，具體配置為LC-20ADXR×2輸液泵，SIL-20AXR自動進樣器，DGU-20A3R在線脫氣機，CTO-20AC柱溫箱，CBM-20A系統控制器，LCMS-8050三重四極桿質譜儀，LabSolutions Ver.5.91色譜工作站）；超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山超聲儀器有限公司）；Milli-Q Reference超純水器（美國Millipore公司）；Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8 μm，美國Waters公司）；0.22 μm尼龍濾膜（上海安譜科學儀器有限公司）。

試劑：乙腈、甲醇、乙酸、乙酸銨（HPLC級，Dikma公司）；甜蜜素（Sodium cycamate）、糖精鈉（Saccharin sodium）、安賽蜜（Acesulfame-K）、阿斯巴甜（Aspartame）、三氯蔗糖（Sucralose）、甜菊糖苷（Stevioside）、紐甜（Neotame）、阿力甜（Alitame）、甘草酸（Glycyrrhizic acid）、愛德萬甜（Advantame）、瑞鮑迪苷A（Rebaudioside A）、羅漢果苷V（Mogroside V）、18β-甘草酸（18β-Glycyrrhetinic acid），美國Sigma-Aldrich公司，加拿大TRC公司和德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，純度≥95%。

1.2 標準溶液的配制

分別準確稱取13種人工及天然甜味劑標準品于10 mL棕色容量瓶中，用水或甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為1 mg/mL的單標儲備液，于-18 ℃避光保存。用甲醇稀釋并配制中間濃度的標準工作液，于4 ℃避光保存。根據需要用流動相逐級稀釋，配制成適當濃度的混合標準工作液，現配現用。

1.3 樣品前處理方法

取葡萄酒、黃酒樣品2.0 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容，超聲混勻，過0.22 μm濾膜，濾液供測定。

準確吸取10 mL白酒樣品于50 mL燒杯中，于60 ℃恒溫水浴鍋加熱蒸發至體積不再減少，停止加熱，冷卻至室溫后轉移至50 mL容量瓶中，用超純水多次淌洗燒杯合并溶液至容量瓶，定容，過0.22 μm濾膜，濾液供測定。

1.4 檢測條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm,1.8μm，美國Waters公司）。流動相：（A）甲醇和（B）10 mmol/L乙酸銨水溶液，流速0.35 mL/min；梯度洗脫程序為：0 min，甲醇的體積分數為10%；0～1 min，甲醇的體積分數從10 % 升至50 %，1～3 min，甲醇的體積分數從50%升至80%，3～4 min，甲醇的體積分數從80%升至100%，并保持1.5 min；5.51 min，甲醇的體積分數從100 %降至10 %；5.51～6.5 min，甲醇的體積分數保持10%。柱溫為35 ℃；進樣體積：2 μL。

1.4.2 質譜條件

分析儀器：LCMS-8050；離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：負離子模式掃描；離子源接口電壓：0.5 kV；霧化氣：氮氣3.0 L/min；干燥氣：氮氣10 L/min；碰撞氣：氬氣；DL溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；掃描模式：多反應監測(MRM)；駐留時間：15 ms；延遲時間：3 ms；13種人工及天然甜味劑標準品MRM參數：見表1。

2 結果與討論

2.1 甜味劑種類的選擇

表1 13種甜味劑的保留時間和質譜條件

本研究選擇了13種人工及天然甜味劑，主要包括酒類產品檢測標準中規定檢測的甜味劑（甜蜜素、糖精鈉、安賽蜜等），文獻報道和市場調研酒類產品中可能使用的甜味劑（紐甜、甜蜜素），對于上述常見人工甜味劑我國建立了標準檢測方法，且進行了嚴格的監管[21]，本研究也包含了鮮有文獻報道檢測方法的新型甜味劑（愛德萬甜）及天然甜味劑（甘草酸、18β-甘草酸、羅漢果苷V、瑞鮑甜苷A、甜菊糖苷），覆蓋了市場上較為容易獲得的甜味劑種類。

2.2 色譜和質譜條件的優化

2.2.1 流動相的選擇

流動相是影響峰形、響應值、分離度、柱壓和分析時間的重要因素[22]。反相色譜的流動相通常由有機溶劑（如甲醇、乙腈）和水組成，本研究對流動相進行了考察和優化，結果表明，有機相為強洗脫溶劑乙腈時，組分分離較差，且乙腈比甲醇毒性更大，因此選擇甲醇為分析的有機相。水相常用緩沖鹽溶液和弱酸性溶液，以增加電離度，提升響應值，實驗比較了甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸銨溶液、甲醇-乙酸水溶液3種流動相體系，發現甲醇-甲酸水溶液、甲醇-乙酸水溶液為流動相時，部分甜味劑色譜峰較寬且拖尾嚴重，故選擇甲醇-乙酸銨溶液為流動相，進一步對乙酸銨的濃度進行優化，比較了5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L 3個不同濃度的乙酸銨水溶液的分離效果，發現5 mmol/L乙酸銨水溶液為水相時，響應值較10 mmol/L低，繼續加大其濃度，響應值增加并不明顯，且較高濃度的非揮發緩沖鹽溶液進入質譜，對離子源會造成一定程度的污染。10 mmol/L乙酸銨水溶液為水相時，因瑞鮑迪苷A的一個子離子與甜菊糖苷母離子相同，未達到基線分離，但通過質譜通道，可以完成定量分析，其他11種甜味劑均可達到基線分離，故得到最優的流動相組成為甲醇-10 mmol/L乙酸銨溶液。

2.2.2 質譜條件的選擇

對13種甜味劑分別在全掃描模式（MRM）下進行掃描，分別確定其準分子離子。根據13種人工及天然甜味劑的分子結構特征，大部分甜味劑在電噴霧離子源中易失去H+成為R-COO-和R-SO3-，且在負離子監測模式下準分子離子峰強度高于正離子模式，本研究比較了正離子和負離子模式下各物質的響應值，發現大部分目標化合物在負離子模式下的響應值明顯優于正離子模式，愛德萬甜則在正負離子模式下均有很高的響應，為降低正負離子同時檢測的干擾，均選擇電噴霧離子源負離子模式對其進行檢測。利用儀器的自動優化功能，分別對Q1、Q3、CE等進行優化，確定13種人工及天然甜味劑的母離子和子離子的最佳質譜條件，各化合物的質譜條件見表1。13種人工及天然甜味劑的總離子流圖見圖1。

圖1 13種甜味劑混合標準溶液的總離子流圖

2.3 樣品前處理條件的優化

由于白酒中含有高濃度的乙醇及微量香味成分，使用質譜檢測器檢測時，乙醇會影響待測物的測定。葡萄酒、黃酒中雖然乙醇含量濃度比例較低，但因其含有一定比例的糖類及色素，在質譜測定時，也會造成基質抑制效應。為減少基質效應的影響，本研究對酒精度較高的白酒進行加熱除乙醇，針對葡萄酒、黃酒則進行稀釋后進樣，以降低基質效應的影響。

2.4 方法學評價

2.4.1 方法的線性范圍和檢出限

將13種人工及天然甜味劑的標準儲備液用流動相分別配制系列混合標準工作液，按上文1.4部分所確定的色譜和質譜條件進行檢測，以各組分定量離子色譜峰面積對相應的質量濃度繪制各被測物的標準工作曲線，結果表明，13種人工及天然甜味劑在一定濃度范圍內線性關系良好，相關系數（r2）均大于0.995。以信噪比為3確定方法的檢出限（LOD），以信噪比為10確定方法的定量限（LOQ）。結果見表2。

表2 13種甜味劑的線性范圍、線性方程、相關系數和檢出限

表3 酒類產品13種甜味劑添加回收率和相對標準偏差(n=6)

2.4.2 精密度和回收率

分別選取空白白酒、黃酒、葡萄酒做回收率實驗，用微量移液器向空白酒中準確加入一定量的13種人工及天然甜味劑標準溶液，配成低、中、高3個濃度水平進行回收率實驗，按1.3節所述實驗步驟進行處理和測定，進行6次重復實驗，計算其回收率及相對標準偏差（RSD）。結果表明，各目標物平均回收率在90.6 %～106.5 %之間，相對標準偏差小于8.8%（表3），方法的準確度和精密度均符合多殘留分析的要求。

2.5 實際樣品的測定

按所建立的方法對購自零售超市和商店的共10批次葡萄酒、5批次白酒和5批次黃酒樣品進行了13種人工及天然甜味劑的篩查，每個樣品重復測定3次。所檢葡萄酒樣品中有1個檢出安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素，含量分別為28.93 μg/L、3399.67 μg/L、566.45 μg/L，其余樣品的檢測結果均為陰性。葡萄酒陽性樣品的MRM質譜圖見圖2。

圖2 某葡萄酒樣品中檢出的安賽蜜、糖精鈉和甜蜜素質譜圖

3 結論

本研究建立了高效液相色譜-串聯質譜儀同時測定酒類產品中13種人工及天然甜味劑含量的方法，該方法前處理簡單、分析速度快、靈敏度高。對實際樣品的檢測表明，該方法能夠滿足酒類產品中13種人工及天然甜味劑的分析要求，與國標方法相比，大大提高了分析效率，降低了分析成本。適合大批量酒類產品中13種人工及天然甜味劑的定性和定量分析。