復(fù)合功能微生物在醬香型白酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

劉 宇，管桂坤，萬自然，夏培禹，杜如冰，吳 群

（1.山東蘭陵美酒股份有限公司，山東臨沂 277731；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫 214122）

醬香型白酒具有“醬香突出、幽雅細(xì)膩、酒體醇厚、空杯留香持久”的特點，深受廣大消費者的青睞[1-2]。獨特的風(fēng)味與其復(fù)雜的生產(chǎn)工藝密不可分，而醬香大曲的質(zhì)量則是醬香型白酒風(fēng)格特點的關(guān)鍵所在。目前，中國的經(jīng)濟處于高質(zhì)量發(fā)展階段，消費者對白酒品質(zhì)的要求越來越高。研究表明，微生物的種類及數(shù)量對醬香型白酒的風(fēng)味及質(zhì)量有非常重要的貢獻。因此，如何利用微生物強化醬香大曲，特別是一些對醬香酒品質(zhì)起重要貢獻的功能微生物，具有十分重要的意義。

本研究通過添加3株細(xì)菌（枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌）和2株霉菌（宛氏擬青霉、米曲霉）強化醬香大曲，并將強化大曲應(yīng)用于醬香酒的生產(chǎn)中，以期增強醬香型白酒的典型性。通過功能微生物強化醬香大曲與應(yīng)用試驗表明，添加適宜的微生物可以提升醬香型白酒的感官質(zhì)量，這對北派醬酒的高質(zhì)量發(fā)展具有一定的借鑒意義。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器

菌種：枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、宛氏擬青霉、米曲霉等，均由江南大學(xué)提供。

培養(yǎng)基：肉湯培養(yǎng)基（細(xì)菌用）；PDA培養(yǎng)基（霉菌用）；麩皮培養(yǎng)基（水分50%）。

儀器設(shè)備：YXQ-LS-75SN立式壓力蒸汽滅菌鍋；JHT-系列凈化工作臺；MJX-280S智能霉菌培養(yǎng)箱；FLY-211C恒溫震蕩培養(yǎng)箱；安捷倫7890A氣相色譜儀；安捷倫氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀GC 6890NMS 5975。

1.2 試驗方法

1.2.1 細(xì)菌的擴大培養(yǎng)

獲得功能微生物的純培養(yǎng)→挑取1環(huán)單菌落→種子液培養(yǎng)（試管）→一級擴大培養(yǎng)（250 mL三角瓶，10%接種量）→二級擴大培養(yǎng)（3000 mL三角瓶，10%接種量）→強化應(yīng)用

1.2.2 霉菌的擴大培養(yǎng)

獲得功能微生物的純培養(yǎng)→挑取3～5環(huán)單菌落→500 mL三角瓶（麩皮培養(yǎng)基）→培養(yǎng)2 d→轉(zhuǎn)移至淺盤（麩皮培養(yǎng)基）→0.9%生理鹽水浸出液→強化應(yīng)用

1.2.3 大曲的檢測方法

制曲打量水中加入功能微生物菌液混勻后開始壓曲，每天定時測定大曲品溫，并選取0 d、4 d、8 d、16 d、21 d、60 d時間段對試驗曲水分和糖化力進行跟蹤檢測，按照QBT 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》重點檢測60 d大曲水分、糖化力、液化力、發(fā)酵力和酯化力等指標(biāo)，并結(jié)合大曲鑒評結(jié)果進行分析。另外，大曲的質(zhì)量鑒評參照公司《醬香大曲技術(shù)要求及質(zhì)量鑒定標(biāo)準(zhǔn)》進行評分。

1.2.4 酒醅的檢測方法

強化曲投產(chǎn)后，每天定時測定酒醅發(fā)酵溫度，對試驗窖池選取0 d、5 d、10 d、20 d、26 d時間點進行動態(tài)跟蹤測定，測定項目主要包括水分、酸度、淀粉和還原糖等常規(guī)指標(biāo)，方法參照DB34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》進行。

1.2.5 原酒的檢測方法

首先，統(tǒng)計試驗窖池的出酒率，出酒率＝出酒量/投料量×100 %，其中投料量按3300 kg計算，出酒量統(tǒng)一折算成65%vol的出酒量，最后計算試驗窖池的平均出酒率。其次，醇酸酯物質(zhì)的檢測，主要分析雜醇油、總揮發(fā)酸、總酯、酸酯比等指標(biāo)。最后，原酒的感官質(zhì)量品評，參照公司品評標(biāo)準(zhǔn)，邀請包括國家級評委在內(nèi)的專業(yè)品評團隊對所取酒樣進行系統(tǒng)品評，評分標(biāo)準(zhǔn)參照T/CBJ 003－2016《固態(tài)法醬香型白酒原酒》，略有調(diào)整。

1.2.6 其他檢測方法

揮發(fā)性物質(zhì)檢測，乙醇含量測定等參照王鵬方法[3]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌的強化試驗

2.1.1 大曲中的理化因素變化

添加不同劑量的地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進行壓曲（表1），為了解制曲過程中大曲的理化因素變化情況，對醬香大曲的制作過程進行了跟蹤檢測，結(jié)果如圖1和圖2所示。對照組與強化組之間溫度、糖化力和水分變化趨勢基本一致。品溫的整體變化趨勢為：大曲入房后在第2天即迅速升溫，升溫幅度高達20 ℃；隨著微生物的生長和代謝活動的持續(xù)，在第8天第一次翻曲時仍然維持在49～53 ℃；翻曲過后品溫稍有回落，第10天繼續(xù)攀升，第14天品溫漲至58 ℃左右；溫度保持一段時間后，第15天以后品溫逐漸回落，直至接近環(huán)境溫度。

表1 強化試驗芽孢桿菌在鮮曲中的理論數(shù)量

圖1 制曲過程中大曲品溫變化

由圖2可知，大曲初始糖化力較高，隨著品溫的上升，一直下降至第16天，隨后由于品溫的降低糖化力稍有回升；21 d后隨著水分的降低糖化力逐漸降至60～130 mg/g·h。

表2 強化試驗醬香大曲質(zhì)量鑒定評分結(jié)果

圖2 制曲過程中糖化力和水分變化

2.1.2 大曲的質(zhì)量鑒定

吡嗪類物質(zhì)是重要的呈香呈味物質(zhì)，也是白酒的健康因子，有助于突出醬香型白酒的風(fēng)格特征[2，4]。顏林春等[5]從醬香大曲中篩選到10株功能芽孢桿菌，純培養(yǎng)后強化醬香大曲發(fā)現(xiàn)，大曲中所含的2,3,5,6-四甲基吡嗪含量明顯高于普通大曲。張榮等[6]從高溫大曲中分離得到了3株產(chǎn)醬香香氣的地衣芽孢桿菌，混合發(fā)酵6 d，有悅?cè)说尼u香香氣，并從發(fā)酵液中檢測到乙偶姻、四甲基吡嗪和呋喃扭爾?；舴f玙等[7]從茅臺鎮(zhèn)醬香大曲中分離得到2株地衣芽孢桿菌，強化醬香麥曲，麥曲中吡嗪類含量高達32.8%，其中四甲基吡嗪含量為31.11%。

根據(jù)表2可知，強化曲的感官指標(biāo)稍高于常規(guī)曲，主要表現(xiàn)為醬香氣較濃郁；綜合大曲的感官和理化指標(biāo)初步判定1DB稍好。結(jié)合醬香大曲中HS-SPME-GC-MS揮發(fā)性組分檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，1DB中吡嗪類物質(zhì)分別是1CK和1GB的1.26倍和2.01倍（表3）?？偟膩碚f，1DB的強化效果較好，有待于接下來的釀酒試驗進一步地驗證。

2.1.3 酒醅的理化指標(biāo)

表3 強化試驗醬香大曲中吡嗪類物質(zhì) (mg/g)

高溫發(fā)酵為產(chǎn)生醬香物質(zhì)提供了良好的條件，不僅是生成醬香物質(zhì)的必要條件，同時也是生成乙醇的必要條件[8]。高溫有利于嗜熱芽孢桿菌的生長代謝，從而促進了醬香物質(zhì)的大量生成。根據(jù)圖3可知，1DB組發(fā)酵溫度明顯高于其他兩組，這更有利于醬香物質(zhì)的生成，初步判定1DB組強化效果較好。與1GB組相比，1DB組乙醇增加速率稍大，但低于對照組；另外，1DB組的出酒率也稍高于1GB試驗組（圖4）。選取比較典型的第四輪次醬香酒醅檢測理化指標(biāo)（表4），結(jié)果表明，各試驗組的水分、酸度、淀粉和還原糖這4項指標(biāo)變化相對合理正常，滿足我公司醬香型白酒生產(chǎn)工藝要求。

2.1.4 原酒中的醇酸酯量比關(guān)系分析

從表5可以看出，強化組醬香酒中雜醇油比對照組高10.46%，總酯比對照組高2.81%；與1GB組相比，1DB組雜醇油較低、總酯較高、總揮發(fā)酸較高、酸酯比較高，通過這些指標(biāo)可以初步判定1DB強化效果更好一些。

2.1.5 原酒的感官品評

根據(jù)表6和圖5可知，1DB組品評得分最高，醬香、空杯留香、細(xì)膩度、醇厚度、凈爽度、焦糊味、個性和典型性等8項指標(biāo)整體都較好。相反，1GB組除醬香、焦糊感和個性這3個指標(biāo)較突出外，其他指標(biāo)相對較差，空杯留香最差。因此，以1DB組芽孢桿菌添加劑量為出發(fā)點，繼續(xù)優(yōu)化醬香大曲的強化工藝。

表4 強化試驗第四輪次醬香酒醅理化指標(biāo)

圖3 發(fā)酵過程中酒醅溫度變化

圖4 乙醇含量變化及出酒率

表5 強化試驗第四輪次醬香酒中酸醇酯量比關(guān)系

表6 強化試驗第四輪次醬香酒質(zhì)量品評

圖5 強化試驗第四輪次醬香酒品評輪廓圖

2.2 細(xì)菌與霉菌組合的強化試驗

考慮到細(xì)菌強化試驗部分強化大曲曲質(zhì)較松散、糖化力偏低等，結(jié)合細(xì)菌強化試驗結(jié)果設(shè)計如表7所示的醬香大曲強化與應(yīng)用試驗[9]。

2.2.1 大曲中的理化因素變化

大曲入房后第2天品溫迅速升至51～56 ℃（圖6），曲坯變軟，顏色變深，同時散發(fā)出醇香和酸香。伴隨著各種生化反應(yīng)，在第8天時（第一次翻曲）品溫仍然維持在52～58 ℃，可聞到較濃郁的醬香香氣。翻曲過后，品溫繼續(xù)攀升，在第11～15 d頂溫出現(xiàn)（最高約60 ℃），并維持一段時間（5～7 d）。第二次翻曲（16 d）之后，由于環(huán)境溫度和大曲水分的降低，品溫逐漸下落。第三次翻曲（25 d）后，品溫變化較小，醬香較純正。30 d以后水分低至17%，品溫隨著曲房溫度同步變化，直至接近環(huán)境溫度。

表7 組合強化試驗功能微生物生物量在鮮曲中的控制標(biāo)準(zhǔn) (cfu/g)

圖6 制曲過程中大曲品溫變化

根據(jù)圖7可以發(fā)現(xiàn)，大曲起始糖化力較高，隨著品溫的上升一直下降至第8天，隨后糖化力稍有回升；16 d后糖化力逐漸降至50～90 mg/g·h。

2.2.2 大曲的質(zhì)量鑒定

根據(jù)表8可知，2GG和2DD綜合得分高于對照組2CK，2DG和2GD則低于對照組。因此，相對協(xié)調(diào)的功能微生物比例關(guān)系所制作的強化曲質(zhì)量要好于比例關(guān)系失調(diào)的。結(jié)合醬香大曲中HSSPME-GC-MS揮發(fā)性組分檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，2GG和2DD中吡嗪類物質(zhì)分別是1CK的1.27倍和1.23倍（表9）。另外，通過添加霉菌強化液，曲質(zhì)得到明顯改善，僅個別曲較松散。總的來說，2GG和2DD的強化效果較好，有待于接下來的釀酒試驗進一步地驗證。

圖7 制曲過程中糖化力和水分變化

2.2.3 釀酒過程中的理化因素變化

根據(jù)圖8可知，強化組發(fā)酵溫度明顯高于對照組，這更有利于醬香物質(zhì)的生成；其中，2DG與2DD兩組在入池發(fā)酵3～10 d酒醅溫度較高（34～35 ℃），初步判定其強化效果較好。由圖9可發(fā)現(xiàn)，各試驗組乙醇含量變化情況相差不大；另外，2GG組出酒率與對照組相近，其他強化組出酒率均低于對照組。選取比較典型的第四輪次醬香酒醅檢測理化指標(biāo)（表10），結(jié)果表明，各試驗組的水分、酸度、淀粉和還原糖這4項指標(biāo)變化相對合理正常，滿足我公司醬香型白酒生產(chǎn)工藝要求。

表8 組合強化試驗醬香大曲質(zhì)量鑒定評分結(jié)果

表9 組合強化試驗醬香大曲中吡嗪類物質(zhì) (mg/g)

表10 組合強化試驗第四輪次醬香酒醅理化指標(biāo)

圖8 發(fā)酵過程中酒醅溫度變化

2.2.4 原酒中的醇酸酯量比關(guān)系分析

根據(jù)表11可以看出，強化組醬香酒中雜醇油比對照組高21.27 %～31.75 %，總酯比對照組高13.65%～31.54%；總體而言，2GG組雜醇油居中、總酯較高、總揮發(fā)酸居中、酸酯比偏低，通過這些指標(biāo)可以初步判定2GG強化效果更好一些。

圖9 乙醇含量變化及出酒率

表11 組合強化試驗第四輪次醬香酒中酸醇酯量比關(guān)系

2.2.5 原酒的感官質(zhì)量品評

根據(jù)表12和圖10可知，2GG組和2DG組品評的醬香、空杯留香、細(xì)膩度、醇厚度、凈爽度、焦糊感、個性和典型性等8項指標(biāo)整體都較好，其中2GG組的醬香、醇厚度、典型性和空杯留香最突出；而2GD組和2DD組這8項指標(biāo)均較差，2CK對照組居中。因此，高濃度的霉菌強化液更有利于提升醬香酒的感官質(zhì)量，細(xì)菌強化液的濃度還可以適當(dāng)調(diào)低。

表12 組合強化試驗第四輪次醬香酒質(zhì)量品評

圖10 組合強化試驗第四輪次醬香酒品評輪廓圖

2.3 對比性分析

通過HS-SPME-GC-MS技術(shù)對比性分析2CK、2GG和2DG 3組醬香酒中的揮發(fā)性物質(zhì)，并應(yīng)用Morpheus在線軟件作熱圖分析（圖11），結(jié)果表明，2GG組大多數(shù)微量成分含量明顯高于2CK組與2DG組；2DG組大多數(shù)微量成分含量低于2CK；與2CK和2DG組相比，2GG組絕大多數(shù)呈香呈味的酯類、醇類、吡嗪類（2,5-二甲基-3-丁基吡嗪等）等物質(zhì)含量得到明顯提升。結(jié)合2.2的分析最終判定：2GG組強化效果最好。

3 結(jié)論

通過3年醬香大曲強化與應(yīng)用試驗，初步優(yōu)化了功能微生物的添加種類與劑量組合，即每1 g鮮曲中添加地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、淀粉芽孢桿菌、宛氏擬青霉和米曲霉的生物量分別為8.7×104、5.8×104、7.5×104、2.0×105和2.0×103cfu，性能較優(yōu)。利用此工藝制作出的強化大曲，醬香香氣較濃郁，將其應(yīng)用于醬香酒的生產(chǎn)后，酒體的醬香、空杯留香、細(xì)膩度、典型性等指標(biāo)都得到了明顯改善，大大提升了公司醬香酒的質(zhì)量水平。

本試驗僅從醬香酒的品評角度出發(fā)，優(yōu)化醬香大曲的強化工藝，并通過基本的理化指標(biāo)來輔助判定強化效果，還未涉及到微生物變化和發(fā)酵規(guī)律解析，有待于進一步的研究。

圖11 第四輪醬香酒微量成分熱圖比較