新型雌激素膜受體GPR30與子宮內膜容受性及卵母細胞成熟的關系

周麗媛，毛增輝

(湖南省婦幼保健院生殖中心，長沙 410007)

2002年，G-蛋白偶聯受體30(G-protein coupled receptor 30，GPR30)被發現是除雌激素核受體(ERα和ERβ)外的一種G蛋白偶聯七次跨膜受體[1-2]。作為一種新型的雌激素膜受體，GPR30從發現至今一直是研究的熱點，其主要介導雌激素的快速非基因反應，如腺苷酸環化酶(cAMP)、內皮細胞一氧化氮合酶系統(eNOS)、環磷酸鳥苷(cGMP)和超氧化物歧化酶等信號轉導通路的活化。隨著GPR30在卵泡細胞中被發現，其與生殖領域的相關性逐漸被廣泛關注。本文探討GPR30與子宮內膜容受性及卵母細胞成熟這兩個與輔助生殖助孕成功率密切相關的因素之間的關系。

一、GPR30的發現

雌激素有多種受體，包括眾所周知的核受體(ERα和ERβ)及新型的膜受體GPR30。1997年在人MDA-MB-231乳腺癌細胞和人MCF7乳腺癌細胞中，利用差異cDNA文庫篩選技術發現并克隆了GPR30的cDNA，但當時并沒有發現GPR30是一種雌激素受體[1]。直到2002年，通過將GPR30質粒轉染至人類乳腺癌細胞MDA-MB-231中，發現GPR30參與了雌激素介導的cAMP-表皮生長因子受體激活等快速作用，首次證實了GPR30是一種新型雌激素受體[2]。2004年研究者們發現GPR30的表達可以被其反義寡核苷酸序列阻滯，并證實了GPR30是G蛋白偶聯七次跨膜受體家族中的一員[3]。

人類GPR30基因位于染色體7p22.3，該基因由3個外顯子組成，GPR30氨基酸的編碼區位于第3個外顯子。GPR30由375個氨基酸組成，分子量約為40～50 KDa[4]。在GPR30發現后，其命名并不統一，直到2007年才確定了官方名稱：G蛋白偶聯雌激素受體-1(GPER1)，但目前廣泛使用的名稱依然是GPR30[5]。GPR30分布廣泛，可表達于內質網、質膜和胞內小泡等膜結構[6]。

自從發現GPR30后，研究者們致力于研究這一新型雌激素受體的具體作用。研究發現雌激素的慢反應是由其經典的核受體(ERα及ERβ)介導的，通過調控相關基因轉錄、蛋白質翻譯等基因反應進行，通常需要幾小時的時間[7]；然而雌激素參與的許多快速非基因反應是由GPR30介導的，如cGMP、eNOS和超氧化物歧化酶等信號通路的活化[8-9]。短期使用雌激素能降低絕經后高血壓婦女的外周血管阻力和血壓，若長期使用雌激素能提高血管對血管舒張因子[如一氧化氮(NO)]的敏感性，雌激素的這些作用均與雌激素膜受體GPR30密切相關[10]。提示雌激素是通過膜受體GPR30，而非核受體(ERα及ERβ)，介導血管的舒張作用[10-11]。

二、GPR30與子宮內膜容受性

GPR30作為雌激素膜受體，主要介導雌激素的快速非基因作用，包括促進細胞增殖，降低細胞凋亡，促進血管生成、舒張血管、降低血管阻力等。GPR30廣泛分布在乳腺、卵巢、子宮內膜、宮頸、滋養層細胞、胎盤血管、睪丸及前列腺等組織中[12-17]。但目前研究多集中于其與相關腫瘤發生的關系，如子宮內膜癌、乳腺癌、宮頸癌等。GPR30參與這些惡性腫瘤的發生，并與腫瘤預后密切相關[13-15]。其中子宮內膜癌患者GPR30的表達顯著升高，GPR30通過PI3K/AKT等相關信號通路促進子宮內膜細胞增殖[13]。

隨著研究的深入，GPR30特異性激動劑G1轉基因動物被應用到對GPR30的研究中。之前在離體小動脈環的體外實驗研究中表明，G1能夠舒張豬的冠狀動脈，小鼠的腸系膜動脈、主動脈和頸總動脈，人的乳腺動脈等[13]。GPR30的血管舒張作用比較復雜，我們之前在人臍靜脈血管內皮細胞中的研究證實，GPR30與雌激素結合后，可促進血管內皮生長因子(VEGF)合成，從而促進血管生成；同時可通過PI3K/AKT通路調節血管擴張劑NO的合成，進而調節血管舒張[18-19]。NO可參與調節胎兒-胎盤血管反應性、降低胎盤床血管阻力、增強滋養層細胞浸潤能力、降低滋養層細胞凋亡、降低絨毛間隙血小板粘附和聚集等，在促進胚胎存活、組織重塑、免疫抑制和對胎盤營養轉運等方面發揮著重要的支持作用[20]。人子宮內膜中存在一氧化氮合酶(NOS)，其能在氧氣存在的條件下，催化L-精氨酸分解生成NO和L-瓜氨酸，NO在促進胚胎著床過程中具有重要作用。有證據表明NO/NOS系統能夠改變子宮內膜螺旋小動脈的形成與植入，促進子宮內膜的蛻膜化改變，在胚胎植入過程中可能起著重要的作用[21]。且我們之前在滋養層細胞體外實驗研究中表明，GPR30激動劑能夠增強滋養層細胞的增殖、侵襲等能力，促進胚胎植入[16，22]。因此，GPR30可能通過調節NO/NOS系統，從而舒張血管、降低小血管阻力，促進小血管生成、促進子宮內膜蛻膜化等，改善子宮內膜容受性；且GPR30可能通過增強滋養層細胞的侵襲能力，降低滋養細胞的凋亡，促進胚胎植入，繼而改善妊娠結局。

GPR30參與了多種生殖系統事件，包括卵泡形成、子宮內膜細胞增殖、增加子宮對催產素的收縮反應、促進精子增殖、抑制精子凋亡等[16，22]。此外，與正常女性相比較，子宮內膜異位癥患者、子宮腺肌癥患者及多囊卵巢綜合征(PCOS)患者子宮內膜上的GPR30表達均存在差異。研究表明與正常參與者的子宮內膜相比，子宮內膜異位癥患者子宮內膜中GPR30表達量升高[23-24]。通過對正常女性及子宮腺肌癥患者子宮組織GPR30的單核苷酸多態性(SNPs)進行分析，發現子宮腺肌病患者子宮組織的GPR30的SNPs表達不同，即GPR30的SNPs在子宮腺肌病組中，與子宮腺肌癥疾病進展相關的rs4266553的C等位基因出現多態性更為常見，提示GPR30的基因多態性可能與子宮腺肌病發病相關[25]。研究者檢測了PCOS患者及正常女性植入期子宮內膜中ERα、ERβ和GPR30的表達量，結果發現PCOS患者種植窗子宮內膜的GPR30表達較正常者顯著下降，可能影響胚胎著床，相關分子機制研究尚未見報道[26]。子宮內膜異位癥患者、子宮腺肌癥患者及PCOS患者合并不孕的概率較高，且這些患者行輔助生殖助孕成功率及持續妊娠率都較正常女性低，但具體機制目前尚不明確。子宮內膜異位癥患者、子宮腺肌癥患者及PCOS患者中，子宮內膜GPR30的表達量不同或者基因多態性不同，可能降低這些患者的子宮內膜容受性，增加不孕癥的發生并影響其輔助生殖助孕的結局，但具體機制需要進一步的研究證實。

三、GPR30與卵母細胞成熟

卵泡液是卵丘冠復合物、卵泡膜細胞和顆粒細胞增殖分化的微環境，卵母細胞的生長發育依賴卵泡液中的各種生長因子和激素，其中E2水平較為重要。研究表明HCG扳機日血清E2水平可能和卵子成熟、受精以及胚胎質量存在正相關的關系，雖然卵泡E2水平顯著高于血清E2水平，但兩者濃度呈正相關，因此外周血內E2的水平可以間接反映卵泡液E2的水平，外周血E2水平可以作為預測卵母細胞是否成熟的標志[27]。人們在研究魚類卵母細胞與雌激素關系的實驗中發現，體外培養液E2的濃度與卵母細胞內內源性cAMP含量呈正相關，而卵母細胞內高水平的內源性cAMP對維持卵母細胞減數分裂停滯是必須的；E2通過增加卵母細胞內內源性cAMP水平，從而抑制卵母細胞減數分裂及成熟[28-29]。而且有學者發現過高濃度的E2可能導致小鼠卵母細胞的凋亡[24]。這些足以說明卵泡液E2水平與卵母細胞成熟存在相關性。近期研究表明，E2是通過激活其膜受體GPR30刺激卵母細胞生成內源性cAMP并保持高水平的內源性cAMP，從而抑制卵母細胞的成熟和減數分裂[30]。卵母細胞與卵丘細胞通過長微絨毛緊密聯系，長微絨毛橫貫于卵母細胞與顆粒細胞之間，使卵丘細胞及卵母細胞間形成橋粒和縫隙連接，卵丘細胞通過這些連接參與卵母細胞的成熟[31]。之前認為雌激素在卵泡成熟過程中的作用很多由ERβ介導，因為有研究發現隨著卵母細胞的不斷成熟，卵泡液中的E2水平及卵丘細胞內雌激素核受體ERβ的表達量也隨之升高，但這些研究結果都不足以闡釋雌激素與卵母細胞發育與成熟的關系[32-33]。近期，研究者們通過使用GPR30的抑制劑或者進行siRNA基因沉默后，顆粒細胞的增殖顯著降低，表明人類卵泡液內E2是通過GPR30受體，而非經典的核受體，介導顆粒細胞增殖的[30]。

從2006年研究者在魚類性腺中發現GPR30開始[34]，雌激素通過GPR30參與卵子成熟的相關性研究引起了研究者們的興趣。有研究者從黃魚卵巢中克隆出了GPR30的cDNA，將GPR30的cDNA轉染至黃魚卵母細胞及HEK 293細胞，發現其穩定表達于細胞質膜上；注射E2或GPR30特異性激動劑G1到黃魚和斑馬魚卵母細胞中，可顯著降低卵母細胞的自然成熟；而GPR30的反義寡核苷酸可以阻斷雌激素對卵母細胞成熟的抑制作用，說明GPR30在調節卵母細胞成熟中起著關鍵作用[35]。同時有學者發現GPR30的小干擾RNA通過阻斷GPR30 mRNA和蛋白的表達，減少了倉鼠卵巢原始卵泡形成，說明GPR30是雌激素刺激卵巢原始卵泡形成中所必須的因子[36]。

2011年，Peyton等[37]在研究斑馬魚的卵母細胞成熟機制中發現，雌激素通過GPR30反式激活EGFR-MAPK信號通路，使MAPK磷酸化激活，進而抑制脊椎動物的卵母細胞減數分裂；且在一定的雌激素濃度范圍內，卵母細胞減數分裂的抑制程度與雌激素水平呈正相關。另外，近期的研究已經清楚的說明，E2通過激活GPR30刺激卵母細胞生成cAMP并保持高水平的內源性cAMP，從而維持魚類卵母細胞減數分裂停滯[30]。而排卵前LH峰激活孕激素膜受體，繼而抑制G蛋白信號通路，降低卵母細胞內內源性cAMP水平，促進卵母細胞的減數分裂。提示排卵前LH峰通過降低魚類卵母細胞內內源性cAMP，促進卵母細胞減數分裂；而GPR30通過增加內源性cAMP，維持魚類卵母細胞減數分裂阻滯。但目前關于GPR30維持對卵母細胞減數分裂阻滯的具體調控機制尚未完全闡明。

在哺乳動物中，研究者們發現GPR30存在于小鼠卵母細胞內，通過檢測小鼠不同階段卵母細胞GPR30的表達水平發現：成熟卵母細胞中GPR30表達最高，而未成熟卵母細胞中GPR30表達較成熟卵母細胞低；并且體內成熟的卵母細胞較體外培養成熟的卵母細胞，GPR30表達量更高；目前體外成熟的卵母細胞的胚胎發育潛能低于體內成熟的卵母細胞，卵母細胞質膜GPR30的表達量與卵母細胞質量的相關性尚不明確，但推測小鼠卵母細胞GPR30的表達量與小鼠卵母細胞的成熟和卵母細胞質量存在相關性[38]。還有研究發現，在體外培養的山羊和小鼠卵冠丘復合體(COCs)中，卵丘細胞與卵母細胞上都存在GPR30的表達，且定位在細胞的質膜上，E2通過GPR30增加小鼠及山羊COCs中內源性cAMP水平及ERK1/2磷酸化水平，從而促進卵丘的擴展[39-40]。與魚類一樣，卵母細胞中高水平的內源性cAMP以及G蛋白的激活對維持哺乳動物卵母細胞減數分裂停滯是必須的；但是維持內源性cAMP高水平的具體機制尚不明確，推測可能與GPR30相關[41-42]。直到2019年，有研究表明E2可能通過GPR30介導山羊卵母細胞減數分裂的進行，且GPR30介導的卵母細胞減數分裂可能與山羊COCs縫隙連接通透性下降相關，而縫隙連接通透性下調可能是由GPR30-MAPK激酶依賴的CX43磷酸化介導的，其具體機制還需進一步證實[43]。總之，在哺乳動物(山羊及小鼠)生殖過程中，GPR30通過調節COCs縫隙連接通透性參與調節卵母細胞減數分裂，但其具體機制尚未闡明，需要進一步探索。

綜上所述，新型雌激素膜受體GPR30介導雌激素的一些重要作用，目前關于GPR30對子宮內膜血管血流、子宮內膜容受性及卵母細胞成熟的具體調控機制尚處于探索階段。深入研究GPR30可能為改善子宮內膜容受性及人類未成熟卵母細胞體外培養成熟的研究提供新的方向，進一步推進輔助生殖技術的發展。