人卵母細胞體外成熟后受精所形成胚胎篩選模式的建立

狄春光，王慧，王功發，王毅，華科，王麗萍

(浙江省嘉興市婦幼保健院生殖中心，嘉興 314000)

卵母細胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)是一項新的輔助生殖技術，可用于難治性多囊卵巢綜合征(PCOS)患者和促排卵周期中卵巢反應不良患者不成熟卵母細胞的體外培養成熟，目前國內外IVM技術并不是很成熟。有研究表明IVM后的卵母細胞紡錘體結構和染色體構型異常比例要高于正常胚胎[1]，因此如何在IVM胚胎中篩選出正常且發育潛能高的胚胎，是臨床上亟待解決的問題。目前的胚胎形態學評估只能在固定的時間點對胚胎進行觀察[2]，不能對影響胚胎發育潛能的非正常事件，如非二倍性卵裂等進行觀察評估，故胚胎形態學評估在不同發育潛能的胚胎篩選上有一定局限性[3]。而時差成像系統(time-lapse imaging，TLI)為非侵入性胚胎評估系統，通過對培養中的胚胎進行連續觀察，獲得與胚胎發育相關的動力學參數，從而準確評估其發育潛能[4-5]，是對胚胎形態學評估的一個有力補充。因此本研究利用TLI結合胚胎形態學評估方法建立一種新的IVM胚胎篩選模式，以期為臨床實踐中挑選高發育潛能的胚胎移植提供參考，以提高患者臨床妊娠率。

資料與方法

一、研究對象

收集2016年2月至2019年5月于本中心接受IVF/ICSI-ET助孕治療患者的402枚未成熟卵母細胞進行IVM培養。卵母細胞IVM后行ICSI授精，精子來源均為患者丈夫，受精后的胚胎在TLI系統中觀察培養。排除標準：合并艾滋病、梅毒、乙型肝炎抗原陽性患者。本研究通過本院醫學倫理委員會審查，所有患者夫妻雙方已簽署知情同意書。

二、研究方法

1.IVM培養液準備：G-2 plus胚胎培養液(Vitrolife，瑞典)，含有0.2 μg/ml 17β-雌二醇(Sigma，美國)、75 U/L FSH和150 U/L HCG(Serono，瑞士)。

2.未成熟卵母細胞的收集及培養：所有患者從上一月經周期排卵后7 d或月經第2天開始注射達菲林(Ipsen，法國)針劑0. 1 mg/d，降調節至少14 d后檢查性激素水平，達降調水平，開始注射果納芬(Serono，瑞士)或麗申寶(珠海麗珠制藥)進行控制性促排卵，至雙側卵巢內有2個或2個以上的卵泡直徑達 18 mm時，注射重組HCG 250μg(Serono，瑞士)，36 h后在陰道超聲引導下取卵。ICSI前剝除卵母細胞周圍的大部分顆粒細胞，經倒置顯微鏡觀察卵母細胞的成熟程度，選擇未成熟卵母細胞(GV期或MI期)供本研究使用。將未成熟卵母細胞移入IVM培養液中培養24～40 h，如果卵母細胞成熟則行ICSI受精，受精卵在TLI系統中培養。

3.TLI系統使用及胚胎培養：使用Primo Vision(Vitrolife，瑞典)TLI系統，圖像每5 min采集1次，共連續培養6 d。所有胚胎均采用WOW 9孔培養皿，卵裂期胚胎培養液為37℃、6%CO2平衡過夜的G-1 plus(Vitrolife，瑞典)培養液。囊胚培養為37℃、6%CO2平衡過夜的G-2 plus(Vitrolife，瑞典)培養液，培養過程中均有Primo Vision成像系統采集圖像，并進行胚胎發育的動力學參數與卵裂模式分析。

4.胚胎發育時間參數和卵裂模式設定：胚胎發育各時間點的命名方法參照Ciray標準[6]，將ICSI受精時間記為“0”點，原核消失時間(tPNF)，發育至2細胞時間為t2，發育至3細胞時間為t3，以此類推為t4、t5。2細胞發育至3細胞所需時間為cc2，3細胞發育至4細胞所需時間為s2，比較第3天(D3)IVM胚胎未形成囊胚組(A組)和形成囊胚組(B組)相應的動力學參數。胚胎的卵裂模式包括正常卵裂、非軸性卵裂、不均、卵裂球碎裂、非二倍性卵裂、發育停滯等。

5.胚胎評估標準：卵裂期胚胎評估參考Peter標準[7]，囊胚期胚胎評估參考Gardner標準[8]。D3可移植胚胎：細胞數≥4個，碎片≤30%，胚胎內無異常結構；D3優選胚胎：細胞數7～12個，碎片≤20%；D3次選胚胎：D3可移植胚胎中優選胚胎除外的胚胎。

三、統計學分析

采用SPSS 25.0軟件對數據進行統計學分析。胚胎動力學參數tPNF、t2、t3、t4、t5、cc2、s2等計量資料不符合正態分布，以中位數(四分位數)[M(Q25，Q75)]表示，組間比較用非參數Kruskal-Wallis秩和檢驗。對非二倍性卵裂發生率、囊胚形成率等計數資料用頻數和率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、胚胎形態學評估選擇發育潛能更高的IVM胚胎

本研究共納入402枚未成熟卵母細胞進行IVM培養，共有315枚成熟，成熟率為78.4%；對315枚IVM成熟卵母細胞進行ICSI后，正常受精219枚，形成D3可移植胚胎數162枚。按胚胎形態學標準評估，在D3獲得優選胚胎95枚，次選胚胎67枚。優選胚胎和次選胚胎的囊胚形成率比較，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 兩組囊胚形成率比較(%)

二、IVM胚胎卵裂模式與囊胚形成的關系

通過TLI觀察，我們發現在219枚受精卵中非二倍性卵裂的發生率最高(24.2%)，其后分別為正常卵裂(21.9%)、不均(17.8%)、發育停滯(16.9%)、非軸性卵裂(10.1%)、卵裂球碎裂(9.1%)。IVM胚胎中正常卵裂胚胎的囊胚形成能力最高(52.1%)，其次是非軸性卵裂胚胎(45.5%)，再次為分裂不均胚胎(35.9%)，卵裂球碎裂最低(10.0%)，發育停滯和非二倍性卵裂胚胎均無囊胚形成(表2)。

表2 IVM胚胎中各卵裂模式的發生率和囊胚形成率(n=219，%)

三、動力學參數對IVM胚胎發育潛能的預測性

D3 IVM胚胎未形成囊胚組(A組，111枚)和形成囊胚組(B組，51枚)相應的動力學參數進行比較，發現兩組動力學參數tPNF、t2、t3、cc2、s2比較均無顯著性差異(P>0.05)，t4、t5比較有顯著性差異(P<0.05)(表3)，提示t4、t5對IVM胚胎的發育潛能具有一定預測性。B組t4、t5的參數值范圍分別為(24.6～41.9)h和(26.1～56.9)h，該范圍內的IVM胚胎具有更高的囊胚形成能力。

表3 兩組動力學參數比較[M(Q25，Q75)，h]

四、TLI結合胚胎形態學評估建立IVM胚胎篩選模式

首先在D3 IVM胚胎中排除發生非二倍性卵裂的胚胎，非二倍性卵裂胚胎為廢棄胚胎(即E級胚胎)。然后再按胚胎形態學評估將IVM胚胎分為可移植胚胎和廢棄胚胎，繼續將可移植胚胎分為優選胚胎和次選胚胎，結合形成囊胚最佳的t4、t5動力學參數范圍，再篩選出A、B、C、D四級胚胎。A級胚胎符合優選胚胎標準，且胚胎t4、t5動力學參數均在最佳范圍內；B級胚胎符合優選胚胎標準，胚胎t4、t5動力學參數不在最佳范圍內；C級胚胎符合次選胚胎標準，胚胎t4、t5動力學參數均在最佳范圍內；D級胚胎符合次選胚胎標準，胚胎t4、t5動力學參數不在最佳范圍內。胚胎移植或冷凍優先級為A>B>C>D(圖1)。

圖1 IVM胚胎篩選模式

五、驗證篩選模式下所選胚胎的囊胚形成能力

再次收集123枚未成熟卵細胞，經IVM成熟92枚，受精后得到D3可移植胚胎43枚。在所建立的篩選模式下篩選出A級胚胎14枚、B級胚胎11枚、C級胚胎8枚、D級胚胎10枚，繼續囊胚培養，結果優選胚胎囊胚形成率44.0%。該模式下各級胚胎的囊胚形成率如下：A(64.3%)>B(18.2%)>C(12.5%)>D(10.0%)。該模式所選出的A級胚胎囊胚形成率顯著高于優選胚胎(64.3% vs. 44.0%)(P<0.05)，證實該篩選模式在IVM胚胎高發育潛能胚胎的篩選中有較高的應用價值。

討 論

如何快速有效地挑選高發育潛能的IVM胚胎，一直是臨床上亟待解決的問題。本研究中我們利用TLI系統結合卵裂期胚胎形態學評估，建立了有效準確的IVM胚胎篩選模式，有利于優化篩選胚胎流程，快速挑選出高發育潛能的胚胎進行移植，經篩選后的A級胚胎囊胚形成率為64.3%，遠高于胚胎形態學評估所得優選胚胎的囊胚形成率44.0%，具有非常大的臨床應用價值。

胚胎發育過程中，一些非正常事件的發生，如非二倍性卵裂、不均、發育停滯、非軸性卵裂、卵裂球碎裂等，都可能預示著胚胎未來的命運[9]。非正常事件中不均、發育停滯可以通過在D1、D2、D3等固定時間點對胚胎進行形態學觀察對照發現，而非二倍性卵裂、非軸性卵裂和卵裂球碎裂則很難被傳統胚胎形態學評估方法發現，TLI技術對胚胎不間斷地連續觀察，可獲取胚胎發育全過程的動態影像，能對胚胎發育進行更加全面和細致的記錄[10]，因此非軸性卵裂、非二倍性卵裂、卵裂球碎裂可在TLI觀察下迅速被發現。本研究中非軸性卵裂、卵裂球碎裂等胚胎均有囊胚形成，而非二倍體卵裂胚胎的囊胚形成率為0%，并且非二倍性卵裂發生率最高(24.2%)，因此我們認為在IVM胚胎篩選中應首先剔除非二倍性卵裂胚胎。王珊珊等[11]報道非二倍性卵裂胚胎的優質囊胚形成率僅為2.16%。Athayde等[12]報道非二倍性卵裂胚胎的囊胚形成率為11.7%，種植率只有3.7%，建議非二倍性卵裂作為胚胎篩選的排除條件。因此，本研究中我們建立的IVM胚胎篩選模式中首要的排除條件為非二倍性卵裂胚胎。

目前已有很多研究將TLI技術運用到胚胎篩選評估中，主要通過胚胎動力學參數對胚胎發育潛能進行預測[13-15]。本研究中我們發現t4形成囊胚的最佳范圍為(24.6～41.9)h，當t4>41.9 h時囊胚形成能力下降。Yang等[16]利用TLI系統研究其動力學參數對138枚受精卵發育成囊胚的影響，發現當t4>41.3 h時，胚胎形成囊胚能力下降。與我們的結果相似，也從側面證實參數t4的重要性。t5同樣可以作為胚胎發育潛能的預測性參數，Meseguer等[15]對285例ICSI周期患者胚胎的卵裂時間、卵裂球大小和多核等做了詳細的回顧性分析，總共移植了522枚胚胎，結果顯示當t5最佳范圍為(48.8～56.6)h時，其胚胎種植率約40%，遠高于其范圍之外的種植率。本研究中我們確定的t5最佳范圍為(26.1～56.9)h，比Meseguer等[15]的確定范圍略大，分析其原因可能為各中心的促排卵方案、培養環境及人員操作等差異造成了各中心提取的共性參數有所不同。因此，各生殖中心應該根據最適合本中心的共性參數，挑選優質胚胎進行移植。

胚胎形態學評估雖然有一定局限性，但其挑選的正常優質胚胎的囊胚形成率依然可達60%以上，且效率遠高于TLI，依然是各大實驗室胚胎評估的主要方法。而TLI雖然有很多優點，但考慮到價格因素，每臺TLI系統加上配套耗材估計使用價格達百萬元以上，因此現階段大規模的TLI應用還不現實，但對于反復移植失敗、高齡、需IVM等特殊患者的應用，能提高TLI的使用價值。尤其使用TLI結合胚胎形態學評估對胚胎進行篩選，可使篩選高發育潛能胚胎的效果得到提高[17-18]。對反復移植失敗、高齡、需IVM等患者而言，其胚胎染色體異常的概率遠大于正常患者，利用TLI結合胚胎形態學評估方法從中篩選高發育潛能的胚胎，可以顯著提高這些患者的妊娠率。本研究中我們進行IVM培養的不成熟卵母細胞是當患者的優勢卵泡直徑達18 mm時經過取卵后獲得，患者所獲得的卵母細胞大部分已成熟，不成熟卵母細胞只占小部分，患者有足夠正常成熟卵母細胞來源的胚胎移植，因此IVM胚胎的臨床應用價值仍然具有一定局限性[19]。而在臨床上經典的IVM促排方案中，當優勢卵泡直徑達10 mm～12 mm時，超聲引導下經取卵術獲得的卵母細胞均不成熟，經IVM培養后才能成熟，并具有受精形成胚胎的能力。因此臨床上經典的IVM促排方案對因卵泡發育遲緩影響卵母細胞成熟的不孕患者來說意義重大。利用TLI結合形態學評估方法建立的這種針對IVM胚胎的篩選模式，對經典IVM促排方案來源的IVM胚胎篩選，具有極高的借鑒和應用價值。