354例耳聾高危兒及39例先天性耳聾患者基因突變分析

張釧，周秉博，張慶華，王興，郝勝菊，陳雪，李富萍，劉亞利，劉青，馬旭，曹宗富*

(1.國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081；2.北京協和醫學院研究生院，北京 100730；3. 甘肅省婦幼保健院醫學遺傳學中心，蘭州 730050)

耳聾是人類最常見的感覺缺陷之一，耳聾在新生兒中的發病率約為1/1 000[1-2]。約有50%～60%的耳聾是由遺傳因素引起的[3]。耳聾的遺傳方式有常染色體隱性遺傳、常染色體顯性遺傳、線粒體遺傳及X/Y連鎖遺傳。目前已經有超過110多個基因被報道與耳聾相關[4]。流行病學研究表明GJB2、SLC26A4和12SrRNA是遺傳性耳聾最常見的致病基因[2]。耳聾的遺傳學診斷非常重要，它可以為患者家庭提供治療決策、預后信息和遺傳咨詢。本研究采用耳聾基因芯片、Sanger測序法及高通量測序Pannel法，對在甘肅省婦幼保健院遺傳中心就診的354個耳聾高危兒及39個耳聾患者家系進行耳聾基因診斷分析，并為這些家庭提供遺傳咨詢及產前診斷。

資料與方法

一、研究對象

收集2015年5月至2019年12月在甘肅省婦幼保健院遺傳中心就診的354例漢族耳聾高危兒患者及39例漢族耳聾患者家系的臨床資料。本研究經甘肅省婦幼保健院倫理委員會批準[2016院倫審研第(4)號]，血樣的采集及臨床資料的收集征得所有家系成員的同意，并簽署知情同意書。

二、基因組DNA提取

采集耳聾高危兒足跟血干血斑，其父母抽取外周血2～3 ml；耳聾患者及其父母抽取外周血2～3 ml。干血斑及外周血基因組DNA分別按照干血斑基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)與血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)的說明書進行。耳聾患者家庭的先證者母親再孕時，于孕18～21周經腹行羊膜腔穿刺，抽取羊水15 ml。按羊水細胞基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說明書進行模板DNA的提取，于-20℃保存備用。

三、耳聾基因芯片檢測

使用晶芯十五項遺傳性耳聾相關基因檢測試劑盒(北京博奧晶典)檢測GJB2基因c.35delG、c.176_191del16、c.235delC及c.299_300delAT 4個位點；GJB3基因c.538C>T 1個位點；SLC26A4基因c.2168A>G、IVS7-2A>G、c.1174A>T、c.1226G>A、c.1229C>T、c.1975G>C、c.2027T>A及IVS15+5G>A 8個位點；線粒體12SrRNA基因chrM-1494C>T及chrM-1555A>G 2個位點。PCR擴增條件：37℃ 10 min，95℃ 15 min，95℃ 30 s，57℃ 30 s，70℃ 45 s，35 cycles；60℃ 10 min，12℃暫停。芯片雜交：50℃水浴1 h。掃描判讀：結果由晶芯十五項遺傳性耳聾相關基因檢測分析系統自動判讀。當探針的檢測信號值大于或等于該探針位點的cut off值時，判斷該探針為陽性；當探針的檢測信號值小于該探針的cut off值時，判斷該探針為陰性。

四、GJB2及12S rRNA基因突變分析

基因外顯子擴增引物由上海生工公司合成。PCR擴增體系為25 μl：其中2×Taq PCR Mastermix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μl，基因組DNA模版1.5 μl(濃度20～50 ng/μl)，上下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μl，ddH2O 10 μl。PCR引物及擴增條件見表1，由于GJB2擴增產物較長，除了正反向測序外，同時使用兩條測序引物進行測序反應，兩條測序引物(5’-3’)分別為：TGGGTTTTGATCTC-CTCGATG，GCCTACCGGAGACATGAGAAG。PCR擴增產物經瓊脂電泳鑒定后對目的條帶單一的產物采用PCR產物純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化后，由ABI 3500型(ABI，美國)測序儀進行測序，測序結果使用SeqMan軟件與標準序列進行比對分析，鑒定GJB2及12SrRNA是否存在突變。

表1 引物序列、產物大小及擴增條件

五、高通量測序Pannel分析

耳聾患者經GJB2及12SrRNA基因突變分析后，仍未明確突變者，采用高通量測序Pannel法(北京邁基諾基因科技股份有限公司)進行耳聾相關基因檢測以明確致病突變，測序平均深度為200×，大于20×的靶向reads達到97%以上。

六、數據分析

高通量測序得到的結果與參考基因組(GRCh37/hg19)比對得到所有變異的文件，對檢測到的堿基變異進行篩選，應用PolyPhen2(http：∥genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和 MutationTaster(http：∥www.mutationtaster.org/)軟件對新變異進行蛋白功能預測，新變異致病性判讀依據美國醫學遺傳學與基因組學會2015指南[5]。計數資料以率(%)表示。

結 果

一、耳聾高危兒基因芯片檢測

晶芯十五項基因芯片檢測發現，354例漢族耳聾高危兒中，316例高危兒未檢測到突變，有21例檢測到了GJB2基因突變，其中17例高危兒檢測到GJB2雜合突變，2例高危兒檢測到GJB2復合雜合突變，2例高危兒檢測到GJB2純合突變；有16例患者檢測到了SLC26A4突變，其中11例高危兒檢測到SLC26A4雜合突變，1例高危兒檢測到SLC26A4復合雜合突變，4例高危兒檢測到SLC26A4純合突變；1例患者檢測到12SrRNA均質突變。

GJB2突變中，突變頻率最高的位點是c.235delC，其次為c.299_300delAT；SLC26A4突變中，突變頻率最高的位點是c.919-2A>G(IVS7-2A>G)，其次為c.1174A>T與c.2168A>G(表2)。

二、耳聾患者Sanger測序和高通量Pannel測序

Sanger測序及高通量Pannel測序發現，39例漢族耳聾患者中，有13例檢測到了GJB2基因突變，其中9例檢測到復合雜合突變，2例檢測到純合突變，2例僅檢測到雜合突變；有15例患者檢測到了SLC26A4突變，其中8例檢測到復合雜合突變，5例檢測到純合突變，2例檢測到雜合突變；10例患者檢測到12SrRNA均質突變；1例患者檢測到LOXHD1復合雜合突變。

GJB2突變中，突變頻率最高的位點是c.235delC，其次為c.299_300delAT及c.109G>A；SLC26A4突變中，突變頻率最高的位點是c.919-2A>G(IVS7-2A>G)，其次為c.1174A>T、c.2162C>T、c.410C>T和IVS15+5G>A(表2)。

表2 耳聾高危兒及耳聾患者耳聾基因致病位點分布

三、耳聾患者家系產前診斷分析結果

39例漢族耳聾患者家系中，有6例先證者明確診斷的家系在再次妊娠時進行了遺傳咨詢及產前診斷。6例胎兒中，有3例檢測到了與先證者相同的致病突變，2例胎兒僅檢測到1個致病突變，1例胎兒未檢測到與先證者相同的致病突變(表3)。

表3 耳聾家系產前診斷結果

討 論

遺傳性耳聾的致病基因受遺傳背景影響，在不同地區、不同人種中耳聾致病基因及其突變頻率存在明顯的差異；在中國，GJB2、GJB3、SLC26A4及12SrRNA是遺傳性耳聾的主要致病基因[6]。在本研究的39例漢族耳聾患者中，GJB2突變檢出率為33.3%、SLC26A4突變檢出率為38.5%、12SrRNA突變檢出率為25.6%，高于國內新疆和福建地區報道的耳聾患者這三個基因的攜帶頻率[7-8]。在本研究中，GJB2(c.235delC)位點及SLC26A4(c.919-2A>G)是最主要的突變位點，這與多個地區的文獻報道[6，9-11]相一致。

我國已經普及了新生兒的聽力篩查，有效降低了出生缺陷，但由于超過50%～60%的耳聾是由遺傳因素造成，僅進行聽力篩查不僅無法明確病因還會漏掉遲發性耳聾的檢出。本研究中，354例耳聾高危兒中有38例(10.7%)檢測到了耳聾基因突變，其中9例(2.54%)確診為耳聾患者，1例為母系遺傳藥物性耳聾的易感個體。目前，國內多個省份地區已經開展了聽力篩查+耳聾基因篩查的模式，有效提升新生兒異常檢出率，可以更好地進行耳聾防治干預[12-14]。對新生兒進行耳聾基因篩查能及早發現母系遺傳藥物性耳聾的易感個體，通過用藥指導可有效避免因藥物導致的耳聾[15]。然而，目前國內新生兒的耳聾基因篩查只是在一些發達省份及地區普遍開展，在經濟欠發達的西部省份還有待進一步推行新生兒耳聾基因篩查。

多種方法可以進行遺傳性耳聾的基因診斷，包括基因芯片法、Sanger測序法、高通量測序Pannel法及全外顯子組測序法等。臨床上主要使用的是基因芯片法、Sanger測序法和高通量測序Pannel法。目前新生兒耳聾基因篩查主要使用的是耳聾基因芯片法，該方法雖然涵蓋了GJB2、GJB3、SLC26A4及12SrRNA這4個耳聾基因，但是僅包含了少量的熱點突變。近年來，高通量測序Pannel法和全外顯子組測序法逐漸成為遺傳性耳聾基因診斷的重要工具，可以發現一些罕見性的耳聾致病突變基因。

對新生兒進行耳聾基因篩查是預防耳聾的三級措施，對于生育過耳聾患者的家庭來說，明確致病基因及位點后，孕期進行產前診斷可以明確胎兒的基因型，從而有效避免患病胎兒的出生[16-17]。本研究對在甘肅省婦幼保健院診斷的39個耳聾患者家庭中的6個家庭進行了產前診斷，明確了胎兒的基因型，為這些家庭進行了生育指導。

本研究通過對354例耳聾高危兒進行耳聾基因檢測，說明在新生兒中進行耳聾篩查+耳聾基因篩查的模式可以提高異常致病耳聾基因檢出率，盡早地進行耳聾防治干預。高通量測序法可以提高耳聾致病基因的檢出率，并且可以發現罕見的耳聾致病突變基因。通過對耳聾患者家系先證者進行耳聾基因產前診斷，可為這些家庭提供遺傳咨詢并進行生育指導，可以有效降低這些家庭的經濟負擔。