ICSI聯(lián)合氯化鍶輔助激活人卵母細(xì)胞成功妊娠1例及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)

檀暢，王喜良，張金艷，魏威，崔鑫，鄒朋書，于月新

（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，沈陽 110016）

隨著輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，體外受精（IVF）技術(shù)為不孕不育夫婦提供了擁有自己后代的可能性，但I(xiàn)VF對于精子不能結(jié)合卵母細(xì)胞或精子不能穿透透明帶的情況卻無能為力，為解決此類難題，卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。此技術(shù)為許多男性少弱精子癥及無精子癥患者的生育提供了可能，但大量統(tǒng)計(jì)資料表明，采用ICSI的受精率也僅在70%左右，仍有30%的卵母細(xì)胞不受精，卵母細(xì)胞活化不足是ICSI受精失敗的重要因素之一［1］。其原因可能是雖然ICSI操作將精子直接注入卵母細(xì)胞，但其不能激活卵母細(xì)胞，無法完成后續(xù)的第二極體排出、DNA去緊密化、原核形成等過程，導(dǎo)致受精失敗。因此，ICSI應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域，雖然取得了不錯(cuò)的臨床效果，但仍然不能完全避免受精失敗的發(fā)生，有研究認(rèn)為ICSI操作中完全受精失敗的發(fā)生率約為2%～3%［2］。我中心也有類似ICSI后受精失敗的病例出現(xiàn)。分析其原因，發(fā)現(xiàn)ICSI操作受精失敗的卵母細(xì)胞中有80%以上處于MⅡ期阻滯狀態(tài)。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展，有研究報(bào)道可以通過物理或化學(xué)的人工輔助激活方法使卵母細(xì)胞胞漿內(nèi)產(chǎn)生鈣脈沖信號(hào)，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂從而改善ICSI受精失敗的結(jié)局，并獲得正常發(fā)育的胚胎［3］。國外已有利用人工輔助卵母細(xì)胞激活技術(shù)進(jìn)行助孕治療并最終獲得健康且發(fā)育正常嬰兒的報(bào)道［4］。2015年，Karaca等［5］應(yīng)用鈣離子載體成功激活卵母細(xì)胞并最終獲得健康胎兒。Eindhoven等［6］通過比較正常分娩嬰兒和通過輔助卵母細(xì)胞激活技術(shù)出生的嬰兒發(fā)現(xiàn)，二者的發(fā)育并未出現(xiàn)顯著差異。本研究回顧性分析我院收治的一對不育夫婦采用氯化鍶（SrCl2）輔助激活卵母細(xì)胞并行ICSI助孕成功妊娠的臨床資料，以期為臨床上卵母細(xì)胞激活的應(yīng)用方案積累資料。

一、資料與方法

1．病例資料：不育夫婦中女方26歲，男方28歲，婚后未避孕但6年一直未孕。2016年因男方重度少弱精子癥，在外院行ICSI助孕，采用拮抗劑方案，予普利康150U啟動(dòng)，Gn 11d，經(jīng)陰道穿刺取卵（OPU）獲卵21枚，均未受精。染色體結(jié)果提示：46，XX，21ps＋。2017年來我中心就診，男方在我院精液常規(guī)檢查結(jié)果及服藥后復(fù)查結(jié)果均提示：嚴(yán)重少弱精子癥。

2．治療方案：夫妻雙方簽署知情同意書后行人工輔助激活卵母細(xì)胞ICSI助孕，并獲本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采用本生殖中心常規(guī)的IVF－ET促排卵長方案［7］進(jìn)行控制性促排卵，卵泡徑線達(dá)18mm時(shí)注射 HCG（艾澤，默克－雪蘭諾，德國）10 000U，36h后在陰道B超引導(dǎo)下穿刺取卵。女方于2018年8月30日取卵，獲卵19枚，其中15枚成熟卵。由于男方患有重度少弱精子癥，因此采用密度梯度離心法處理精液，將液化后的精液加入37℃恒溫的3ml梯度離心培養(yǎng)液中，600 g離心20min；吸出沉淀，加入3ml精子沖洗培養(yǎng)液后300 g離心5min待用。鏡下計(jì)數(shù)離心前后精子的濃度、活力。取卵后4h行ICSI。

ICSI操作前，取1mg SrCl2（Sigma，美國）置入1 338．56μl二甲基亞砜（DMSO）中溶解，分裝成每支10μl，－20℃冷凍儲(chǔ)存，此為100×濃縮液。用時(shí)取出1支，加至1ml培養(yǎng)液，終濃度為10mmol／L。ICSI后1h，將受精卵放入上述激活液內(nèi)，培養(yǎng)箱（保溫、保濕、氣體平衡）中作用30min，培養(yǎng)液滴內(nèi)洗滌5次以上，轉(zhuǎn)移至Quinns－1026卵裂液常規(guī)培養(yǎng)。

激活后16～18h進(jìn)行原核評估，見到2個(gè)清晰獨(dú)立的原核為正常受精卵。其中4枚胚胎出現(xiàn)雙原核（即正常受精），培養(yǎng)至第3天（D3）得到4枚卵裂期胚胎，考慮到存在卵巢過度刺激綜合征（OHSS）風(fēng)險(xiǎn)，放棄鮮胚移植，挑選2枚發(fā)育良好的卵裂胚進(jìn)行玻璃化冷凍；剩余2枚胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至D7，僅形成1枚囊胚進(jìn)行冷凍，另1枚胚胎退化。

二、結(jié)果

2019年1月3日復(fù)蘇該患者的2枚D3胚胎，復(fù)蘇存活率為100%。采用人工周期方案準(zhǔn)備內(nèi)膜，月經(jīng)期開始使用補(bǔ)佳樂（戊酸雌二醇1mg／片，拜耳醫(yī)藥，德國）4mg，1周后B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度，達(dá)到8mm左右時(shí)給予黃體酮注射液（浙江仙琚制藥）60mg／d肌肉注射轉(zhuǎn)化內(nèi)膜。之后將兩枚復(fù)蘇胚胎移植回體內(nèi)。移植后14d妊娠試驗(yàn)陽性，之后保持隨訪，B超檢查顯示單胎存活，常規(guī)產(chǎn)檢至8月27日順產(chǎn)分娩一男嬰，體重2 700g，孕周36＋3周，各項(xiàng)指標(biāo)正常。

三、討論

精子和卵母細(xì)胞受精過程中啟動(dòng)減數(shù)分裂恢復(fù)的關(guān)鍵因素是Ca2＋振蕩。在哺乳動(dòng)物中，外源性的生理刺激可誘導(dǎo)其發(fā)生。卵母細(xì)胞激活的過程可通過人工誘導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)，較常用的方法包括：電刺激的物理方法；在常規(guī)ICSI中將精子注入卵母細(xì)胞質(zhì)膜時(shí)反復(fù)多次抽吸胞漿的機(jī)械刺激法；將卵母細(xì)胞暴露于Ca2＋載體 A23187、乙醇、伊屋諾霉素、SrCl2、巴豆醇、硫柳汞、蛋白質(zhì)合成抑制劑或蛋白磷酸化抑制劑中等化學(xué)激活方法［8－12］。

現(xiàn)階段，人工卵母細(xì)胞輔助激活是治療既往ICSI受精低下或失敗的有效措施之一［13］。應(yīng)用相對廣泛的主要有 Ca2＋載體［14］、6－二甲基氨基嘌呤（6－DMAP）［15］和等化學(xué)方法，其中SrCl2通過促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)存儲(chǔ)的Ca2＋釋放來增加細(xì)胞內(nèi)游離Ca2＋的濃度。Sr2＋與Ca2＋是同族的陽離子，其可經(jīng)細(xì)胞膜上的Ca2＋通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，再通過磷酸肌醇途徑進(jìn)入鈣池，置換出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中的Ca2＋，使胞質(zhì)內(nèi)游離的Ca2＋增加。進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Sr2＋不僅引起內(nèi)源性Ca2＋的釋放并且不被消耗進(jìn)而引起Ca2＋震蕩，不僅與正常受精非常相似，而且具有頻率低、幅度小、持續(xù)時(shí)間長等特點(diǎn)，能有效激活卵母細(xì)胞［17］。SrCl2在動(dòng)物中的應(yīng)用較為廣泛，目前其在人卵母細(xì)胞輔助激活中的應(yīng)用在國內(nèi)鮮有報(bào)道。國外有研究報(bào)道了5例Sr2＋輔助卵母細(xì)胞激活后分娩的嬰兒，觀察嬰兒出生后12個(gè)月內(nèi)身體和智力的發(fā)育情況，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)異常［18］。亦有文獻(xiàn)報(bào)道，6例患者使用10mmol／L SrCl2輔助激活卵母細(xì)胞后行鮮胚移植、凍融胚胎移植，最終4例患者成功妊娠，分娩健康嬰兒［19］。國外有學(xué)者跟蹤隨訪8名ICSI聯(lián)合SrCl2輔助激活分娩的嬰兒至60個(gè)月，發(fā)現(xiàn)8名嬰兒均發(fā)育正常、身心健康，與正常分娩的兒童無明顯差異［20］。上述研究在一定程度上證實(shí)了Sr2＋輔助激活卵母細(xì)胞方法的安全性。

不可否認(rèn)，卵母細(xì)胞激活亟須深入研究，若能明確人工輔助激活卵母細(xì)胞安全有效的方法，不僅能解決大部分ICSI受精失敗的難題，并且對IVF受精失敗的卵母細(xì)胞也可以采用補(bǔ)救ICSI聯(lián)合人工輔助激活的處理方式，最大限度地挽救未受精卵母細(xì)胞，提高卵母細(xì)胞受精率，并在一定程度上改善胚胎的發(fā)育潛能，使更多患者獲得臨床妊娠及活產(chǎn)。本病例也是我中心胚胎實(shí)驗(yàn)室首次應(yīng)用SrCl2成功激活卵母細(xì)胞并聯(lián)合使用ICSI使患者獲得臨床妊娠。雖然眾多研究證據(jù)顯示SrCl2能有效激活卵母細(xì)胞，結(jié)合ICSI技術(shù)可以成功妊娠并獲得健康的新生兒，改善既往ICSI受精失敗或受精率低下患者的臨床結(jié)局。但是該方法中依然存在一些問題不容忽視，比如人工輔助激活的穩(wěn)定性，整個(gè)激活過程中任何細(xì)節(jié)的改變，都可能使胚胎面臨風(fēng)險(xiǎn)；SrCl2等不同的化學(xué)激活劑在激活過程中的最佳作用時(shí)間、激活方式等都需要大樣本的研究證實(shí)；目前所報(bào)道出生兒例數(shù)較少，其對子代的潛在影響尚難以確定。因此，對于既往ICSI受精失敗的患者，應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度，在向患者夫婦介紹這種技術(shù)的同時(shí)也要向其詳細(xì)解釋該技術(shù)的風(fēng)險(xiǎn)以及對后代健康可能產(chǎn)生的影響，尊重患者的選擇。且本研究未設(shè)置對照組驗(yàn)證卵母細(xì)胞激活的效果，后期需要增加數(shù)據(jù)收集并完善研究設(shè)計(jì)，進(jìn)行深入的研究和探討，以早日明確其安全性，更好地應(yīng)用于臨床。