植物多酚與花生致敏蛋白相互作用及脫敏機理研究進展

張 馳，李春翼，王啟明，唐瑜婉，趙吉春,2，李富華,2，明 建,2,

（1.西南大學食品科學學院，重慶 400715；2.西南大學食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

花生是主要的食物致敏原之一[1]，花生過敏是血清免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）介導的I型超敏反應，其造成的影響具有致命性和持久性[2]，臨床表現涉及皮膚、消化道、呼吸道等[3]。當前解決花生過敏的方法主要有物理熱加工法、酶處理法、分子生物學方法等，它們仍存在諸多不足，如引入新致敏物質、破壞花生其他營養成分、適用范圍窄等。植物多酚是一種天然植物活性物質，來源廣、綠色安全，具有抗氧化、調節心血管疾病、抗炎、防治糖尿病等生理功能，某些與蛋白質具有良好的結合能力[4-5]，利用植物多酚與花生致敏蛋白相互作用是解決花生過敏的一項新途徑，已有文獻報道植物多酚可以降低花生蛋白致敏性。本文對植物多酚與花生致敏蛋白的相互作用、脫敏的潛在機理進行綜述，總結目前該領域的研究進展，并對今后的發展進行展望。

1 花生過敏

1.1 花生致敏蛋白

花生主要致敏原物質是高度糖基化的致敏蛋白，多屬花生種子貯藏蛋白，微量即可導致過敏[6-7]。目前世界衛生組織/國際免疫學會聯合會過敏原命名小組委員會已公布并命名了17 種花生致敏蛋白，分別為Ara h 1～Ara h 17。在所有致敏蛋白中，Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3、Ara h 6是較為重要的致敏蛋白類型[3]。

1.2 花生過敏的一般過程

花生過敏包括致敏階段和效應階段。1）致敏階段：胃腸道黏膜上的特化上皮細胞——M細胞（一種抗原轉運細胞）將致敏蛋白轉移至抗原呈遞細胞，后者將其加工處理成肽片段，在主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）/T細胞受體（MHC呈遞的多肽與T細胞受體特異性結合，引發后續生化反應）作用下將肽先呈遞給T細胞，再呈遞給未成熟的輔助型T細胞2（T helper 2 cell，Th2），Th2被激活后產生細胞因子，刺激B細胞合成花生特異性IgE抗體[8]。2）效應階段：致敏原與結合在肥大細胞和嗜堿性粒細胞表面的花生特異性IgE結合，后者主要通過高親和力的表面IgE受體Fc?RI結合在相關細胞上，釋放多種炎癥介質，如組胺、前列腺素、白三烯等，具體過程見圖1。此外，局部產生腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-5（interleukin-5，IL-5）和趨化因子使嗜酸性粒細胞激活與聚集[8]。劉志剛等[9]發現花生過敏小鼠模型體內以嗜酸性粒細胞、肥大細胞和淋巴細胞為主的炎癥細胞數目顯著增加，肥大細胞活化狀態明顯，血清中花生過敏原特異性IgE和白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）等細胞因子水平以及腹腔上清液組胺水平顯著增高（P＜0.05），IgG2a（免疫球蛋白G的亞類）和γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）水平極顯著降低（P＜0.01）。

圖1 食物過敏反應的細胞機制[10]Fig. 1 Cellular mechanisms of allergic responses to food[10]

2 常見花生脫敏方法與原理

目前，食品工業中常見的花生脫敏方法主要有：物理熱加工法、基因工程方法、發芽處理法、酶處理法和輻照處理法，它們對花生產生脫敏作用的原理各不相同。

2.1 物理熱加工法

常見的物理熱加工法包括水煮、焙烤、油炸等[11]。熱加工引起致敏蛋白高級結構改變，使表面抗原決定簇包埋或暴露，進而影響蛋白的IgE結合能力，降低或增加其致敏性[12-14]。Maleki等[15]報道了烘烤花生結合特異性IgE的能力比未處理花生高出約90 倍，花生致敏蛋白的美拉德反應產物增強了其致敏性。李穎超[12]采用烘焙、油炸、水煮、高溫高壓處理花生仁，其可溶性蛋白含量減少，過敏原反應性分別降為對照組（未經任何處理）的92%、73%、92%和28%。

2.2 基因工程法

利用基因工程方法可在分子水平上對致敏原相關基因進行操作，這種方法是通過改變花生內源基因從根源上改善蛋白致敏性[7]。易海濤等[16]制備了經點突變的花生主要致敏原Ara h 2，體外實驗表明該重組蛋白具有低致敏性潛能。Chu Ye等[17]通過沉默Ara h 2和Ara h 6基因得到了低致敏性花生。基因工程改造的花生可能存在缺乏原有花生的風味和營養價值等問題[18-20]。

2.3 發芽處理法

發芽處理法是利用在種子發芽過程中，一些貯藏蛋白類致敏蛋白降解成多肽或氨基酸以供給種子生長所需的氮源，從而降低花生致敏原含量[12,21]。李穎超[12]發現花生發芽84 h和132 h后，致敏蛋白免疫抑制率較36 h時分別下降了6.6%和11.5%。

2.4 酶處理法

酶處理法主要包括酶交聯技術和酶分解技術。酶交聯技術通過催化蛋白質內部或分子間形成共價鍵而發生交聯反應，改變蛋白質空間結構，從而引起致敏性變化，目前可用的酶有：谷氨酰胺轉氨酶、多酚氧化酶、過氧化物酶等[22]。Radosavljevic等[23]使用酪氨酸酶處理花生全蛋白，交聯產物致敏性未發生改變。Chung等[24]采用過氧化物酶處理焙烤花生，其酪氨酸殘基發生了交聯，致敏性顯著降低；隨后該團隊又證明了多酚氧化酶可使花生致敏蛋白Ara h 1、Ara h 2形成交聯，從而降低其致敏性[25]。Mihajlovic等[26]利用微生物多酚氧化酶和漆酶交聯花生致敏原，提升了花生致敏性。

酶分解技術則是通過分解致敏蛋白破壞致敏表位結構，降低其與IgE的結合特性，進而降低花生蛋白致敏性。目前常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶[12,21]等。石振鵬等[21]采用一種復合酶制劑（V（堿性蛋白酶）∶V（中性蛋白酶）∶V（木瓜蛋白酶）∶V（風味酶）＝2∶2∶1∶1）花生仁漿，處理后花生致敏蛋白Ara h 1和Ara h 2平均消減率為92.91%。利用微生物發酵法也可分解致敏蛋白從而達到降敏效果，周陽[27]的研究表明，花生蛋白液經枯草芽孢桿菌發酵后與IgE結合能力可下降為零，發酵液中Ara h 1幾乎被消除，Ara h 2含量明顯減低。納豆芽孢桿菌發酵可使花生蛋白液與IgE結合能力下降48%。Hazebrouck[28]和Yu Jianmei[29]等發現胰蛋白酶能水解花生過敏原，有效降低花生過敏原性。

2.5 輻照處理法

輻照處理可以加速蛋白交聯、展開、形成碎片及生成新的反應基團，從而改變蛋白結構，影響蛋白免疫反應性[30-31]。Luo Chunping等[32]利用10 kGy的鈷-60 γ射線輻照劑量處理Ara h 6和花生蛋白總提取物，發現其IgE結合能力下降，蛋白質二、三級結構明顯改變。

以上方法在使用過程中分別具有不同優缺點，具體如表1所示。

表1 常見花生脫敏方法優缺點比較Table 1 Comparative advantages and disadvantages of methods commonly used for allergenicity reduction of peanuts

利用植物多酚與花生致敏蛋白相互作用是解決花生過敏的一項新途徑，已有文獻報道植物多酚與花生致敏蛋白相互作用可以降低花生蛋白致敏性。例如蔓越莓多酚和藍莓多酚與花生蛋白形成復合物后，在體外實驗中能降低花生蛋白與花生特異性IgE的結合能力[36]；人類臨床I期實驗證明多酚配方能降低過敏反應中的嗜堿性細胞數量[37]；經蔓越莓多酚強化的花生粉在體外實驗中誘導的嗜堿性細胞脫顆粒現象和經口刺激花生過敏小鼠體內肥大細胞脫顆粒現象均顯著減少[38]；花生蛋白與多酚結合還可降低小鼠體內特異性IgE的含量[39]。

3 植物多酚與花生致敏蛋白的相互作用

3.1 相互作用力類型

植物多酚與花生致敏蛋白的相互作用力類型包括共價作用力（如經多酚氧化、親核加成等形成）和非共價作用力（氫鍵、范德華力、疏水相互作用、靜電相互作用等）。對蔓越莓和藍莓果渣多酚與花生蛋白形成的復合物進行多酚提取鑒定，發現多酚以游離、共價結合和非共價結合3 種形式存在，且游離多酚含量最高，共價結合多酚含量最低[36]，以苷元或糖苷形式存在的槲皮素與花生蛋白以共價形式結合，多聚和單聚原花青素則以非共價形式與花生蛋白結合[36]。

3.2 結合位點

圖2 大豆β-伴大豆球蛋白（A）和大豆球蛋白（B）的三維結構[41]Fig. 2 Three-dimensional structures of soybean β-conglycinin (A)and glycinin (B)[41]

植物多酚與花生致敏蛋白的結合位點可能在蛋白質中的脯氨酸富集區、二硫鍵處、蛋白質側鏈殘基上。van Boxtel等[40]依據Ara h 1、Ara h 3的三維結構分別與β-伴大豆球蛋白和大豆球蛋白相似（圖2），推測蛋白結構中的脯氨酸富集區是原花青素與花生致敏蛋白的結合位點，Ara h 1含有脯氨酸富集區，因此易與原花青素形成交聯；Ara h 3中脯氨酸排列松散，因此對原花青素親和力小，不易形成交聯。

植物多酚與花生致敏蛋白的結合位點還可能位于二硫鍵處。分子內的二硫鍵常使蛋白質對熱刺激更具穩定性，增強其致敏能力[30]。Ara h 2分子內含有的4 個保守二硫鍵，可維系結構穩定性，保證與IgE結合的活性和致敏性，天然Ara h 2具有胃腸道消化酶耐受性，且酶解后仍具識別IgE能力，若二硫鍵被還原，則極易被酶解且與IgE的結合活性下降[42]。

研究發現，蛋白質側鏈的氨基酸殘基處也可能是多酚與致敏蛋白的結合位點之一。多酚氧化產物醌類是高活性的親電中間體，易被氨基酸側鏈中的親核位點攻擊進而發生親核加成反應，半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸等氨基酸殘基上常具有親核位點[36]。Chung等[25]證明酚類化合物咖啡酸在堿性條件（pH值大于10）可以被氧化成醌類物質，進而與蛋白質中的氨基、巰基或色氨酸殘基作用形成蛋白質交聯，降低花生蛋白致敏性，反應過程如圖3所示。

圖3 咖啡酸在pH 10.5時交聯蛋白質[25]Fig. 3 Cross-linking of protein by caffeic acid at pH 10.5[25]

3.3 結合特征與構象變化

表沒食子兒茶素-3-沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和花生致敏蛋白Ara h 2、Ara h 6的結合親和力、結合常數和結合位點的數目與EGCG和其他球蛋白結合時相似，結合后Ara h 2和Ara h 6均出現相似變化，即α-螺旋含量減少，β-折疊與β-轉角含量增加[43]。

3.4 影響因素

目前發現能降低花生蛋白致敏性的多酚種類包括原花青素[40]、以苷元或糖苷形式存在的槲皮素[36]、咖啡酸[25]、大豆異黃酮[44]、綠原酸和苯甲酸[45]等。影響蛋白和多酚相互作用的常見因素包括溫度、pH值、多酚和蛋白的類型及濃度等[5]。溫度和pH值可能通過影響反應速率、反應物活性、反應物所帶電荷數等影響植物多酚與花生蛋白的相互作用，多酚和蛋白的類型及濃度產生的影響可能在于多酚、花生致敏蛋白本身結構特征的差異，如某種基團的數目和所含特征化學鍵等，但目前在植物多酚與花生致敏蛋白相互作用研究中鮮有系統考慮以上因素。

4 植物多酚降低花生蛋白致敏性的潛在機理

植物多酚降低花生蛋白致敏性的機理可能有兩種：1）單獨植物多酚對過敏反應的干擾作用；2）植物多酚與花生致敏蛋白形成復合物，掩蔽或改變致敏蛋白結構，間接調節過敏反應。

4.1 單獨植物多酚對過敏反應的干擾作用

單獨植物多酚可以通過抑制化學介質釋放和抑制肥大細胞、嗜堿性細胞或T細胞產生細胞因子、信號轉導和基因表達從而干擾過敏反應[46]。綠茶中的EGCG及其甲基化衍生物(-)-表沒食子兒茶素-3-O-(3-O-甲基)沒食子酸酯((-)-epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl)-gallate，EGCG3''Me)可通過抑制人外周血嗜堿性白細胞KU812中的Fc?RI受體表達從而減弱過敏反應[47]。單獨加入蔓越莓多酚或藍莓多酚時，肥大細胞的組胺釋放量和β-氨基己糖苷酶釋放量出現不同程度降低[36]。植物多酚的抗過敏作用具有非特異性，如類黃酮能夠通過抑制DC的功能抑制小鼠模型中的花生過敏[44]。可可中的原花青素低聚物可以刺激先天性和早期適應性免疫，這種抑制DC和巨噬細胞的功能不是針對某種特異的抗原，不具有致敏原特異性[46]。

4.2 植物多酚與花生致敏蛋白形成復合物導致后者結構改變，間接調節過敏反應

花生致敏蛋白和植物多酚結合可以引起其構象變化，進而改變抗原表位結構特性，最終影響抗原結合能力，改變蛋白致敏性[13,30,48-49]。花生致敏蛋白Ara h 2、Ara h 6和EGCG結合后致敏性降低，蛋白螺旋結構含量減少，β-折疊及無規卷曲含量增加，結構穩定性下降[44]。分別用蔓越莓多酚和藍莓多酚與花生蛋白制備含質量分數30%多酚的復合物，與未加多酚的對照組相比，蔓越莓多酚和藍莓多酚制得的復合物與IgE結合能力分別下降38%、31%，并使離子霉素誘導的大鼠嗜堿性細胞白血病細胞（rat basophil leukemia cells，RBL-2H3）的組胺釋放量分別下降65.5%、65.8%，β-氨基己糖苷酶釋放量分別下降60.7%、45.4%[36]。花生蛋白與漿果多酚結合后與IgE結合能力下降，且蛋白二級結構發生變化[50]。此外，大多數食物致敏原均具有高胃腸道消化酶抵抗性[48]，富含EGCG的綠茶多酚提取物與花生致敏蛋白結合后可促進胃蛋白酶對抗消化食物過敏原的消化，從而降低致敏作用[49]。

植物多酚與花生致敏蛋白結合可抑制過敏反應中的相關信號通路。如在速發型過敏反應中，Ca2+內流可引起肥大細胞脫顆粒作用[36]，花生衣中的多酚與花生蛋白形成聚合物后可抑制Ca2+誘導的絲裂原活化蛋白激酶信號通路引起的細胞脫顆粒[51]。植物多酚-花生蛋白復合物的致敏性降低可能包括3 個原因：1）消化酶更易于破壞復合物中IgE的結合表位；2）多酚結合的蛋白表位不能被致敏原特異性IgE識別；3）交聯蛋白使表位不能被含致敏原特異性的IgE肥大細胞和嗜堿性細胞在消化過程中識別[52]。

5 結 語

目前關于植物多酚降低花生蛋白致敏性的研究內容主要集中于測定花生致敏蛋白與多酚結合前后的以下指標：在體外與特異性IgE的結合能力、對肥大細胞脫顆粒作用的抑制能力（測定β-氨基己糖苷酶和組胺釋放水平）、經胃腸道酶消化后花生蛋白的組成及含量等，對花生致敏蛋白與植物多酚的相互作用和脫敏機理的深入研究及報道較少。

未來的研究方向可能包括：1）深入探討植物多酚脫敏作用機理，關注相關信號的基因表達等；2）探究致敏蛋白和植物多酚的相互作用如作用力類型、結合常數、結合位點等，找到致敏蛋白中決定脫敏作用的結構變化；3）關注不同多酚組合類型的脫敏效果；4）關注植物多酚在胃腸道消化過程中對消化酶及腸道菌群的作用；5）關注其他食物基質對花生致敏蛋白的影響。