基于斑馬魚全生命周期毒性測試的研究進展

薛柯，許霞，薛銀剛,,*，穆云松，劉菲，江曉棟，施昕瀾，顧銘

1. 常州大學環境與安全工程學院，常州 213164 2. 江蘇省環境保護水環境生物監測重點實驗室，江蘇省常州環境監測中心，常州 213001 3. 中國環境科學研究院，環境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012 4. 江蘇理工學院化學與環境工程學院，常州 213001

斑馬魚(zebrafish,Daniorerio)是一種原產于印度和南亞河流的小型熱帶魚[1]，自1994年起作為一種全新的脊椎動物模型被學術界接受[2-3]，它的器官、細胞類型、心血管系統、消化系統與哺乳動物相似[4-5]。另外，斑馬魚與人類的遺傳和生理同源性顯著[6]，大約70%的人類基因至少有一個明顯的斑馬魚直系同源物[7]，神經系統組織和代謝與人類類似[8-9]，生物學特性接近于人類生長全過程[10]，它還有易于獲得、價格低廉、容易飼養、符合“3R”原則、測試周期短并且在適當的光周期條件下能產出大量粘附性低、可浸泡、透明的魚卵等優點[11-13]，在生態毒理學和發育遺傳學等領域中得到了廣泛的研究[14]，相對于小鼠、果蠅和線蟲等模式生物，近年來斑馬魚的應用地位顯著[15]。

斑馬魚的生命階段主要包括胚胎(卵裂期、囊胚期、原腸胚期、分裂期、成形期和孵化期)、仔魚和成魚3個階段，72 hpf(hour post fertilization, hpf)進入早期仔魚階段且主要器官發育完成，96 hpf時大多數器官發育完成，120 hpf時仔魚發育完成[16-17]。生命周期試驗主要分為2類：整個生命周期試驗(full life cycle test)和部分生命周期試驗(partial life cycle test)[18]，毒性主要包括一般毒性(急性毒性、亞慢性毒性、慢性毒性、蓄積毒性和局部毒性等)和特殊毒性(致癌作用、致突變作用、生殖和發育毒性等)[19]。利用PubMed數據庫，以zebrafish embryo, zebrafish larvae, zebrafish adult和zebrafish life cycle為限定條件，以toxicology為限定區域統計發現，近10年來，斑馬魚生命周期的毒理學研究所占比重不斷上升并呈穩定增長的趨勢(圖1)。本文綜述了斑馬魚全生命周期毒性的研究進展，為深入研究毒性物質對魚類以及其他高等脊椎動物生長發育的影響提供一定的參考依據。

1 斑馬魚各生命階段在毒理學中的研究進展(Research progress on partial life cycle test of zebrafish in toxicology)

1.1 斑馬魚胚胎在毒理學中的研究進展

1.1.1 急性毒性及發育毒性的研究進展

急性毒性是指機體(人或實驗動物)一次或短期內(一般指24～96 h)多次接觸外源化合物之后所引起的中毒效應，這種毒性效應可以反映在不同的組織水平上，并伴隨著不同的癥狀，甚至死亡[19]。20世紀70年代，Laale[20]對斑馬魚胚胎在生態毒理學領域的應用進行了報道，后來Lange等[21]使用斑馬魚及其胚胎和RTG-2細胞進行毒性試驗，結果證明，胚胎測試對毒性反應最敏感，并且認為胚胎毒性測試是替代魚類急性毒性測試的最佳方法。

圖1 斑馬魚生命周期相關的論文及占比Fig. 1 Statistical analysis of scientific papers related to zebrafish life cycle

2002年Nagel[22]進一步證明斑馬魚胚胎可以替代魚類96 h的急性毒性試驗，同年，德國率先使用斑馬魚胚胎48 h毒性試驗(fish embryo toxicity, FET)代替魚類急性毒性試驗，自2005年以來，FET已成為德國全廢水毒性試驗(whole effluent test, WET)的重要組成部分[23]。在進行斑馬魚胚胎急性毒性測試的同時，也可以篩選發育不正常的胚胎作為致畸作用指標，相關研究人員總結斑馬魚胚胎形態學、亞致死等毒性終點(表1)，如心跳變化、運動行為和孵化率等，這些終點豐富了毒性內容，且表明了化學物質可能存在的發育毒性和慢性毒性效應[24]。

1.1.2 內分泌干擾毒性的研究進展

內分泌干擾毒性的主要原因在于天然激素水平的失衡，而引起激素水平失衡的物質大多數來源于人類的生產和生活過程中產生和排放的污染物，由于這類物質具有與生物體內激素相同的活性，會影響生物內分泌系統的正常工作，因此稱之為“環境內分泌干擾物(environmental endocrine disrupters, EEDs)”[25-26]。目前，大多數報道以特定的終點如性別分化或誘導卵黃蛋白原(vitellogenin, VTG)來研究對雌激素、雄激素和甲狀腺受體起作用的EEDs的影響[27]。斑馬魚胚胎模型在內分泌干擾毒性研究中的應用是通過觀察EEDs暴露對激素應答基因的影響進行檢測篩選，VTG作為敏感型的分子生物標記物，已被廣泛應用于斑馬魚胚胎模型中[28]。然而，在斑馬魚胚胎模型中尚未有雄激素和糖皮質激素的報道，對于這些終點的檢測原則上可以通過轉基因報告菌株分析其應答基因，但是現有的菌株，如pERE tata-Luc，只被成功地運用到仔魚或成魚階段[29]。對內分泌干擾毒性的分析，特別是對不直接干擾受體調控基因(如性別分化)，需要在仔魚敏感的發展階段進行。因此，斑馬魚胚胎可以作為簡單的篩選工具，但在研究更復雜的激素調節過程中的應用尚待開發。

表1 斑馬魚胚胎急性毒性和致畸性的終點[22]Table 1 Lethal and sublethal endpoints for evaluating the acute toxicity and teratogenicity of chemicals on zebrafish embryos [22]

注：*在致畸毒性試驗中，只有卵凝結判定為死亡；** 暴露48 h后將胚胎轉移到沒有試驗化合物的水中；120 hpf仔魚變直，可以精確地測量尾長。

Note: *Within the teratogenicity test for a better comparison with mammalian data only the endpoint "coagulated" is used as a lethal effect. ** In this case the eggs are transfered into water without the test compound after 48 h. After natural hatching the larvae is straightened and the tail length can be determined.

對斑馬魚胚胎的毒理研究還涉及神經毒性、遺傳毒性和基因技術等領域[30]。MacRae和Peterson[31]還報道了斑馬魚及其胚胎在藥物開發中的應用，并提出斑馬魚模型與傳統藥物開發方法的結合有助于平衡藥物毒性和療效。斑馬魚胚胎在毒理學研究中的前景主要是：(1)確定更合適的分子標記物作為毒性測試指標(如內分泌干擾毒性)；(2)建立短期毒性測試(如急性毒性)和長期毒性測試(如慢性毒性和發育毒性)之間的關系；(3)斑馬魚胚胎模型的開發及應用可以為環境管理決策服務；(4)斑馬魚及其胚胎在醫學領域的研究可以擴大其在毒理學的應用。

1.2 斑馬魚仔魚及成魚在毒理學中的研究進展

一般在完成孵化后48～72 h的斑馬魚可以自由運動并且能夠自主取食，標志著正式進入了仔魚期，斑馬魚仔魚發育要持續數周，因此，目前針對仔魚的毒性試驗除短期暴露外，還有長期暴露試驗。由于斑馬魚仔魚具備自主游動能力，因此，一些工作以仔魚行為作為評價指標，進行毒性試驗。斑馬魚成魚四月齡進入性成熟期，一般5～6月齡的斑馬魚開始被用于成魚毒性試驗中。由于斑馬魚成魚體內的各種生理生化系統和內分泌系統己經發育完畢，所以能用于毒性評價的指標非常豐富，成年斑馬魚相比于胚胎和仔魚，最大的優勢在于可以取出處理后斑馬魚體內的不同器官，來具體評價污染物對不同器官或組織的影響[32]。斑馬魚相對于其他模式生物應用于毒性檢測而言，節省了時間和人力成本，具有快速、簡便和高效的優勢，降低了人和生態系統面臨的毒性風險，是一種應用潛力更大的環境污染應急預警方法，被國際標準化組織(International Organization for Standardization, ISO)、經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-Operation and Development, OECD)和歐盟等組織認定為標準毒性測試生物(表2)。

野生型斑馬魚在毒理學中得到了廣泛的應用，但這種方法仍有不足之處，如檢測靈敏度度相對較低，實驗過程及結果統計相對繁瑣等。隨著轉基因技術的日益成熟，將具有特異性調控作用的基因導入斑馬魚體內，從而產生針對不同種類污染物可產生特異性表型的轉基因斑馬魚，使針對不同污染物的分子生物標志物數據庫不斷擴展，為污染物環境監測與預警提供更多的數據支持[33]，為環境樣品中關鍵致毒物質篩查提供新的解決思路[34]。

目前，應用于環境監測的轉基因斑馬魚主要有以下5種類型：芳香烴反應元件(aromatic hydrocarbon response element, AHRE)、親電反應元件(electrophile response element, EPRE)、金屬離子反應元件(metal response element, MRE)、雌激素反應元件(estrogen response element, ERE)和維甲酸和類維生素X反應元件(retinoic acid and retinoid X response elements, RAREs, RXREs)(表3)。隨著科學技術手段的不斷進步，將來會有更多的轉基因(反應元件)斑馬魚品系建立。各種帶有不同反應元件的轉基因斑馬魚胚胎可以像基因芯片一樣排列在微孔板中，可以準確地檢測出水環境中各種污染物的種類，并根據熒光強度來推算污染物的濃度[48-49]。Petersen等[44]通過暴露轉基因斑馬魚tg(cyp19a1b-GFP)胚胎監測5種不同的環境雌激素，結果發現，所潛在的和弱的類雌激素都能夠監測到。此外，Pawar等[38]將轉基因斑馬魚(pTol2-MT-Ia1-DsRed2)的胚胎暴露至Cd2+、Cu2+、Hg2+、Pb2+和Zn2+溶液中，通過觀察熒光強度確定毒性強弱。

2 斑馬魚多階段毒性評價及整個生命周期的毒理學研究進展(Research progress on multi-stage and complete life cycle toxicity evaluation)

2.1 斑馬魚多階段毒性評價及整個生命周期在毒性測試中的應用

隨著對魚類毒性試驗了解的不斷深入，人們逐漸發現傳統的單一生命階段毒性試驗提供的數據較為片面，不能客觀全面地反映有毒化合物對生物的毒性，大量研究已經發現，對于同一有毒污染物，不同生命階段的魚會表現出不同的敏感性和中毒反應，多階段毒性評價能夠避免由生命階段不同而導致的敏感性差異[50-51]。通過整個生命周期毒性試驗可以發現低劑量有毒化合物暴露的影響，并有助于建立長期化學品的安全濃度，提供可能的延遲毒性的詳細信息[52]。在毒理學評價中，單個生命階段的毒理學試驗結果較為片面，而整個生命周期的毒性試驗時間跨度較大，對外界環境要求較高，實際操作起來難度較大。因此，許多毒性試驗選擇3個單獨的斑馬魚生命階段(胚胎、仔魚和成魚)[53]。斑馬魚不同的生命階段有著不同的毒性測試標準體系，在多階段毒性評價中可以參照對應的標準(表3)進行試驗。筆者查閱OECD、ISO、美國環境保護局(United States Environmental Protcction Agency, US EPA)和日本環境省等標準資源庫發現，目前US EPA(Fish Life Cycle Toxicity, 1996)和日本環境省(the Medaka (OryziasLatipes) Full Life-Cycle Test Guideline, 2002)制定了魚類整個生命周期毒性試驗。

表2 利用斑馬魚生命周期開展毒性測試的標準Table 2 Standard for zebrafish life-cycle toxicity test

注：LC50表示半數致死濃度，EC50表示半數效應濃度，NOEC表示無可觀察效應濃度。OECD表示經濟合作與發展組織，ISO表示國際標準化組織。

Note: LC50stands for median lethal concentration; EC50stands for median effect concentration; NOEC stands for no observed effect concentration; OECD stands for Organization for Economic Co-Operation and Development; ISO stands for International Organization for Standardization.

表3 不同反應元件的轉基因斑馬魚在環境監測中的應用Table 3 Application of transgenic zebrafish with different response elements in environmental monitoring

注：AHRE表示芳香烴反應元件，MRE表示金屬離子反應元件，ERE表示雌激素反應元件，EPRE表示親電反應元件，RAREs表示維甲酸反應元件，RXREs表示類維生素X反應元件。共有序列中，N=A, T, G或C；R=A或G；W=A或T。

Note: AHRE stands for aromatic hydrocarbon response element; MRE stands for metal response element; EPRE stands for electrophile response element; RAREs stands for retinoic acid response element; RXREs stands for retinoid X response elements. Within each consensus sequence, N = A, T, G, or C; R = A or G; W = A or T.

在魚類毒性檢測的環境污染物中主要分為重金屬、內分泌干擾物和有機物[54]。最早提出魚類生命周期毒性試驗的Mount和Stephan[55]將黑頭呆魚的整個生命周期暴露于馬拉硫磷和丁氧基乙醇酯中定量分析黑頭呆魚的生長繁殖所受的影響。隨著斑馬魚模型的開發和應用，越來越多的研究針對這3類物質開展斑馬魚多階段毒性評價和整個生命周期毒性試驗。通過不同的評價方法，不同的暴露時長，以形態變化、基因表達、行為和生理學特征等指標來評價污染物的毒性(表4)。

2.2 國內斑馬魚及其毒性試驗標準的發展

斑馬魚在我國生物科學中的研究始于1998年，孟安明院士在清華大學建立國內第一家以斑馬魚為模式動物的發育生物學實驗室[49]。2000年后，斑馬魚研究團體飛速增長，截至2017年，中國斑馬魚學者在國際斑馬魚信息中心(the Zebrafish Information Network, ZFIN)網站注冊的獨立實驗室已達100個[56]。國家斑馬魚資源中心隸屬于中國科學院水生生物研究所，其斑馬魚資源保藏庫現擁有1 200多個斑馬魚品系和10 000余份凍存精子，可提供斑馬魚品系等資源服務、轉基因和基因敲除等技術服務、養殖和健康等咨詢服務，以及技術培訓和學術會議服務等[15]。此外，國際也有著相當數量且實力雄厚的斑馬魚生物信息學數據庫(表5)。通過Web of ScienceTMCore Collection (v5.29)數據庫以斑馬魚為主題同時限定區域分析(不含港澳臺) 可知，2000—2001年中國斑馬魚相關研究論文在世界中的占比僅為1.6%，之后中國斑馬魚論文占比持續增長，到了2010年首次突破10%，而到了2017年，更是達到22.9%(圖2)，另搜索中國知網數據庫發現，以“斑馬魚”為主題的中文文獻已有4 010篇(1990—2017年)。

圖2 Web of ScienceTM Core Collection數據庫中1997—2017年中國斑馬魚論文數量及占比Fig. 2 The proportion of Chinese zebrafish papers from 1997 to 2017 from Web of ScienceTM Core Collection datebase

表4 斑馬魚多階段毒性評價和整個生命周期毒性評價的應用Table 4 Application of multi-stage and complete life cycle toxicity evaluation

表5 斑馬魚生物信息學資源庫Table 5 Zebrafish bioinformatics resource library

表6 國內斑馬魚相關標準制定進展Table 6 Progress in the development of domestic zebrafish related standards

在國內標準制定上，1992年出臺的《水質 物質對淡水魚(斑馬魚)急性毒性測定方法》(GB/T 13267—91)中首次將斑馬魚用于水質檢測，經過20余年的發展，已有13個國家標準將斑馬魚作為推薦物種用于測試水質、農藥、廢水和化學品的毒性(表6)。2015年11月原環境保護部發布《關于征求國家環境保護標準<城鎮污水處理廠污染物排放標準>(征求意見稿)意見的函》(環辦函〔2015〕1782號)，并發布《城鎮污水處理廠污染物排放標準》征求意見稿和征求意見稿編制說明向社會征求意見，首次增加綜合毒性指標來反映排放廢水的綜合毒性，包括發光細菌、大型溞、水藻和斑馬魚胚胎急性毒性。

3 展望(Outlook)

斑馬魚以其卓越的生物學特性成為毒理學研究中最重要的模式生物之一，是毒性測試和其他生物研究的哺乳動物模型的一種可替代方案，其全生命周期毒性檢測技術已在重金屬、有機污染物及內分泌干擾物質等方面有了較為廣泛的研究，相關標準正在推進和完善。本文通過綜述斑馬魚全生命周期毒性測試的研究進展，對未來開展相關研究提出以下幾點建議：

(1)斑馬魚不同的生命階段有不同的應用，能滿足不同的需求，以特定的毒性終點來表征化合物的毒性。在胚胎階段確定更合適的分子標記物作為毒性測試指標及建立短期毒性測試和長期毒性測試之間的關系，可初步判斷有毒化合物的毒性類型及潛在危害程度，從而使斑馬魚胚胎模型更好地為環境管理決策服務。

(2)近年來基因組學等組學技術興起，轉基因斑馬魚進行環境污染物毒理學研究成為生態毒理學研究新熱點。隨著各種轉基因斑馬魚的開發和利用，其靈敏度和效率也不斷提高，利用斑馬魚的基因表達來研究毒性機制將更有利于以斑馬魚為模型研究環境污染物對人類健康的影響。

(3)目前國內尚沒有一份針對某一化學品的斑馬魚整個生命周期和多階段毒性試驗的標準規范，建立一套斑馬魚整個生命周期和多階段毒性試驗的標準規范并對重金屬、內分泌干擾物和有機污染物進行毒性評價具有較大的研究價值，對有毒化合物的生態風險評估以及水體污染的生物監測具有一定的指導意義，這將在以后的生態毒理學領域中具有較大的研究價值。

致謝：感謝中國環境監測總站金小偉高工在文章修改中給予的幫助。