磁性納米顆粒對不同模式生物的毒性研究

胡莉娟，沈沁浩，陳章悅，周家豪，熱法提，吳奕帆，王成聰，費承鑫，李華玲

揚州大學醫學院，揚州 225009

隨著科技的發展，納米材料越來越多地被應用于人們的日常生活。人們也越來越多地接觸到納米材料。但其對人類健康的影響及方式仍不十分清楚，尤其是磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles, MNPs)。磁性納米顆粒具有納米材料的表面效應和小尺寸效應，因此，較一般物質更容易通過呼吸、食道甚至皮膚等途徑進入人體內[1]。近年來，磁性納米顆粒在醫學方面的新應用越來越多，如靶向藥物載體、磁共振成像、生物分離、固定化酶以及免疫檢測等[2-6]。但是關于磁性納米顆粒毒性作用及作用機制還尚不清楚。因此，探究其是否對生物產生毒性作用具有重要意義。本文對MNPs作用于幾種模式生物的研究進行了綜述。

1 磁性納米材料的特點(Characteristics of MNPs)

納米材料是由顆粒尺度在1～100 nm的微小顆粒組成的固體體系，其顆粒絕大多數是晶體，特征尺度至少在一個方向上為納米量級[7]。由于小尺寸效應、量子效應、表面效應和界面效應的影響，納米材料除了有傳統材料的優異性能外，還有許多傳統材料不具備的新的優異性能，因此，它的應用涉及到力學、熱學、電學、磁學、光學和生命科學等眾多方面[8-12]。而磁性納米材料作為納米材料的一種，按組成可分為無機磁性材料和磁性聚合物納米材料兩類：無機磁性材料是指具有磁性的無機材料，如Fe3O4、Fe2O3、CoFe2O4和NiFe2O4等，因難分散且易團聚，極大地限制了這類材料的應用；磁性聚合物有很好的順磁性、較高的飽和磁場強度、生物相容性以及較強的磁響應性等，通常可采用連鎖聚合或逐步聚合的方法來制得磁性聚合物。所制備的磁性聚合物多帶有可反應的活性官能團，從而得以進一步修飾制備出多功能的磁性聚合物。經過表面修飾的磁性材料不僅解決了團聚的難題，還在很大程度上改善了磁性納米材料的生物相容性、穩定性及可生物降解等特性，是目前該領域的研究熱點[13]。其中較為常見、并且被廣泛應用和研究的有磁性Fe3O4納米材料、MnFe2O4磁性納米粒子、λ-Fe2O3超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPION)等。磁性納米材料的特性，使其在生物醫藥、環境及軍工等多方面具有難以被取代的特殊地位[14]。例如，Fe3O4磁性納米材料可以用于磁共振造影劑，也可作為靶向藥物載體或利用光熱效應治療腫瘤[15]；硅烷化反應制備乙二胺四乙酸(EDTA)官能化的磁性粒子EDTA-Fe3O4@SiO2可以將水溶液中Pb2+和Cu2+除去[16]。

近來研究發現，納米顆粒會在肺臟、肝、脾、腎甚至骨髓和中樞神經系統[17]中沉積，并引起嚴重的肺部炎癥[18]。沉積情況與納米顆粒的性狀和實驗動物的差異有關[19]。同時，從已有研究中發現，不同修飾的磁性納米材料對細胞、大鼠、小鼠和家兔在一定情況下有明顯的影響作用，本文進行了以下總結。

2 不同磁性納米材料對不同細胞的影響(Effects of different MNPs on different cells)

關于磁性納米材料對細胞的影響，已有大量文獻報道，這里將分為腫瘤細胞、免疫細胞和非免疫細胞3個方面進行介紹。

2.1 對腫瘤細胞的毒性作用

磁性納米材料被用于研發靶向藥物傳遞的治療學，包括各種癌癥治療[20-23]。研究發現，Fe3O4/Al2O3和Fe3O4-mSiO2核殼結構[24-25]的磁性納米粒子可以通過光熱效應殺死細菌和KB癌細胞；體外抗腫瘤活性研究表明，納米Fe3O4槲皮素多巴胺復合物對腫瘤細胞具有一定的選擇性，對人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)、人前列腺癌細胞(PC3)均體現出較強的抑制活性[26]；帶有磷脂-聚乙二醇(PEG)涂層的氧化鐵納米顆粒(iron oxide nanoparticles, IONPs)和阿霉素(DOX)對抗癌細胞時藥物持續釋放，使癌細胞凋亡增加，而高溫可進一步加速癌細胞的凋亡[27]；Actein(即AT，從升麻根莖中分離出的一種三萜苷，有抗腫瘤作用)與Fe3O4(AT-MNPs)聯合應用可誘導非小細胞肺癌(NSCLC)細胞凋亡，并以p53依賴的方式抑制NSCLC生長[28]。大量研究證明，多功能IONPs含有氧化鐵核，表面包覆細胞毒性藥物也可以與高溫結合使用，以進一步證實抗腫瘤反應[29]。因此，磁性納米材料對腫瘤治療的作用是值得肯定的，表面包覆有抗腫瘤的化合物可能會增加對腫瘤治療的作用。

2.2 對免疫細胞的毒性作用

納米技術載體的使用總是需要評估對環境、職業和健康的潛在危險因素。其中一些不良反應包括超敏反應、免疫抑制和免疫刺激，這可能是免疫系統與納米粒子之間“不受歡迎”的相互作用的結果[30]。關于磁性納米材料對免疫細胞影響的研究也有很多。多個研究結果顯示，暴露于IONPs中，U937單核細胞內IONPs增加[31]，刺激了Th1偏倚的免疫反應[32]，單核細胞驅動的內皮細胞功能障礙并引起動脈粥樣硬化[33]。同時，Zhu等[33]的研究表明，IONPs可以激活單核細胞，之后單核細胞通過產生次級信使，導致細胞質空泡化、線粒體腫脹和人主動脈內皮細胞(HAECs)死亡。從該研究中推測IONPs的毒性可能會導致心血管并發癥。也有研究發現，聚乙二醇(PEG)包被的IONPs增加了人單核細胞的活性氧(ROS)、腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細胞介素1β(IL1β)和線粒體功能障礙[34]，而葡聚糖包被的SPION被發現在干細胞和免疫細胞中積累，毒性最小或沒有明顯的毒性和功能變化[13]。另一項研究報告表明，淀粉包被的IONPs改變了細胞骨架和離子通道等微妙的特征[35]。相比之下，聚乙烯醇(PVP)包被的IONPs在不影響單核細胞存活的情況下，細胞內IL1β水平升高[36]。研究表明，葡聚糖包被的IONPs不影響內皮-單核細胞間的相互作用[37]，羧酸功能化IONPs阻止了脂多糖處理單核細胞的炎癥細胞因子反應(IL1β、TNFα和IL6)[38]。這些數據可能表明，顆粒包被有助于免疫細胞存活和細胞因子的分泌，這是對IONPs或其他刺激的反應[29]。但是Tsolakis等[39]將與淀粉樣β1-42(Aβ1-42)結合的硫代乳酸T標記核殼層SPION(Aβ1-42)注入巨噬細胞，發現整個實驗過程中吞噬細胞的功能狀態沒有受到影響。大量研究發現，磁性納米材料會引起免疫細胞的炎癥反應，導致免疫刺激或免疫抑制。

2.3 對其他細胞的影響

體外評價研究表明，納米氧化鐵顆粒膠體懸浮液對人角質形成細胞(HaCat)活性、增殖和遷移缺乏毒性；體內急性皮膚毒性實驗顯示，皮膚生理參數值有一定的變化，皮膚屏障功能未受到明顯影響[40]。殼聚糖包覆的納米氧化鐵顆粒(LMWC-IONPs)對哺乳動物細胞是安全的[41]。但也有文獻報道磁性納米材料有細胞毒性，例如，用Annexin V染色法測定經過納米材料作用48 h后人乳腺MCF-7癌細胞的凋亡發現，Fe3O4納米顆粒實驗組的細胞凋亡率為14%，被葡聚糖包裹的Fe3O4實驗組的細胞凋亡率為11%；細胞凋亡可能是由于細胞對Fe3O4納米顆粒的大量攝取內吞導致的[42]。MNPs在培養6 h后通過內吞作用進入人視網膜色素上皮細胞(ARPE-19)引起的DNA損傷嚴重且難以修復，顯示出一定的細胞毒性和遺傳毒性[43]。多元醇制備的Zn0.8Co0.2Fe2O4在100 μg·mL-1急性暴露實驗中對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)產生毒性，使其存活率顯著降低[44]。“裸”磁性Fe3O4納米顆粒在24 h暴露后致使人肝細胞(HL-7702細胞系)細胞活性顯著降低，并呈劑量依賴性[45]。Fe3O4-TiO2也能降低HL-7702細胞活力和三磷酸腺苷(ATP)水平，而增加丙二醛(MDA)和ROS的生成，線粒體膜透性也發生損傷，Western blotting實驗結果表明，Fe3O4-TiO2NPs能誘導細胞凋亡、炎癥和癌變相關信號蛋白的改變，在低劑量(6.25 μg·cm-2)下，對HL-7702細胞無明顯毒性[46]。與傳統觀念一致，大劑量長時間的暴露，可以明顯增加磁性納米材料的細胞毒性。

3 不同磁性納米材料對大鼠、小鼠的影響(Effects of different MNPs on rats and mice)

鼠作為經常使用的實驗對象，由于其飼養管理方便，易于控制，生產繁殖快，研究深入，因此，廣泛應用于各種實驗研究中。研究顯示，未經改性與經油酸鈉改性的納米Fe3O4顆粒經ICR小鼠口服后，使其肝臟細胞脂肪變性，肺臟在光鏡下觀察到結構紊亂[47]。磁性納米Fe3O4顆粒經尾靜脈注射入小鼠體內24 h后，其血清生化分析發現，肝臟、肺臟和脾臟中Clathrin Heavy Chain蛋白表達增強，受到一定程度的損傷[48]。碳包覆納米材料(CEINs)以劑量依賴性的方式誘導小鼠內皮細胞(HECa-10)線粒體和細胞膜的細胞毒性[49]。但大量文獻發現，磁性納米材料未對鼠類產生明顯毒性。例如，經靜脈途徑給予昆明種小鼠nano-Fe3O4-Glu，未發現其有致突變性，但能通過血腦屏障、血睪屏障和血眼屏障，未見明確毒性[50]。對Wistar小鼠鼻內注射氧化鐵納米粒子發現，血小板計數增加，血清磷酸酶堿性水平下降，腦多巴胺和去甲腎上腺素水平升高，其他指標均正常，情緒和學習記憶能力不受影響，沒有對鼠造成明顯毒性[51]。高性能磁性Zn0.4Fe2.6O4在亞慢性胃內給藥后對小鼠肝臟和腎臟均未產生明顯毒性[52]。殼聚糖包裹的磁性納米材料(Chit@MNPs)在大鼠的血液血管神經學和行為學上均未產生明顯毒性[53]。多數實驗沒有發現磁性納米材料對鼠類有明顯毒性，但是并不能表明磁性納米材料沒有毒性，其毒性機制也尚未清楚。

4 不同磁性納米材料對家兔的影響(Effects of different MNPs on rabbits)

實驗兔是由遺傳背景明確、來源清楚的家兔經人工飼養和繁育，并對其攜帶的微生物及寄生蟲進行控制培育而成，廣泛應用于科學研究、教學、生產、鑒定和其他科學實驗。已有研究表明，磁性納米Fe3O4顆粒以30 mg·kg-1劑量經耳緣靜脈注射入家兔體內24 h后，發現其肺臟出現明顯病理學改變[54]，但是對家兔肝臟和腎臟無明顯損傷[55]。多元醇制備的Zn0.8Co0.2Fe2O4對新西蘭兔肺、肝和腎產生組織毒性[44]。磁性納米材料經靜脈途徑進入體內后，首先被免疫系統的巨噬細胞吞噬而聚集在巨噬細胞較多的組織和器官中，如肝臟和脾臟[55]。因此，磁性納米顆粒進入家兔體內后，較多聚集在肝、脾、腎和肺等器官，當聚集濃度較高時，首先在這些器官出現組織毒性。

5 磁性納米材料對秀麗隱桿線蟲的毒性研究(Toxicity of MNPs to C. elegans)

5.1 磁性納米氧化鐵對線蟲衰老的影響

有研究發現，納米氧化鐵能增強線蟲細胞內ROS活性，導致細胞凋亡和死亡，最終導致蠕蟲的早期死亡[56]。而超氧化物歧化酶(SOD)是一種重要的抗氧化酶，可清除體內的超氧化物。但Keaney和Gems[57]研究發現，編碼SOD基因的缺失，確實會增加氧化損傷，但不會縮短壽命，甚至會增加壽命；同時研究發現，用具有SOD活性的化合物處理可提高對氧化應激的抵抗力，但對線蟲壽命的延長沒有作用[58-61]，而有一項初步研究確實發現了壽命延長的現象[62]，此外，增加活性氧產量可以增加而不是縮短壽命[61,63-64]，這些研究使人懷疑氧化損傷是否導致了與年齡相關的病理和死亡率的增加[65]。

衰老的特點是蛋白質穩態(蛋白質平衡)逐漸減弱。這導致蛋白質聚集增加，類似于在一系列神經系統和其他淀粉樣疾病中觀察到的蛋白質聚集，而膳食鐵的增加顯著加速了線蟲體內與年齡相關的不溶性蛋白質的積累，其中主要包括核糖體、三羧酸(TAC)循環、氧化磷酸化和蛋白酶體等[66]。當線蟲體內ROS水平升高時，活性氧自由基清除劑的活性或含量會出現一定的增加，而酶類抗氧化劑作為一種與年齡相關的不溶性蛋白質，它的增加，是否與線蟲的衰老有關，還需要更多的研究證實。

5.2 CMC-nZVI, IONPs和亞鐵離子對線蟲生殖的影響

Brenner等[67]的研究發現，羧甲基纖維素(CMC)穩定的納米零價鐵(CMC-nZVI)、納米氧化鐵(nFe3O4)和亞鐵離子(Fe(Ⅱ)ap)(aq表示水溶液)對線蟲F0代產生明顯生殖毒性，不同濃度均能提高線蟲F0代細胞內ROS水平，考慮其生殖毒性可能是因為體內ROS水平升高引起的；F0代線蟲僅接觸一次CMC-nZVI，生殖毒性在F1和F2代中繼續出現，在F3和F4代中得以恢復，但F1和F2代中ROS水平與對照組無顯著差異，這表明氧化應激在F1和F2代中并不是以ROS積累的形式表達的，進一步測定了線蟲體內Fe含量的差異，發現CMC-nZVI親本暴露F0代體內鐵總量呈劑量依賴性積累。雖然F1的總鐵積累量與F1對照相比沒有顯著性差異，但總鐵濃度的平均值仍明顯增加，因此，推測CMC-nZVI親本暴露可能導致F0和F1線蟲總鐵濃度的積累，從而導致線蟲的多代生殖毒性。

秀麗線蟲生長發育等各個方面研究的較為清楚，適合作為模式生物進行毒理學研究，從秀麗隱桿線蟲得到的生物學知識也可以直接應用于更復雜的生物[68]，但目前關于磁性納米材料對秀麗線蟲的毒性研究并不多。已經發現的是磁性納米材料的確會提高線蟲體內氧化應激水平，但與線蟲衰老和生殖毒性是否有直接關系及其影響的機制還有待研究；線蟲體內鐵儲存蛋白鐵蛋白(FTN-1和FTN-2)對氧化應激有保護作用[69]，暴露于磁性納米材料中，線蟲體內FTN-1和FTN-2是否發生變化？編碼活性氧自由基清除劑的基因是否表達升高？具體表達升高的基因及其相關的機制通路都有待研究。

6 討論與展望(Discussion and prospects)

磁性納米材料近年來在生物醫學領域頗為熱門，相關研究也越來越多。雖然，其在抑制腫瘤細胞活性方面有明顯作用，但是對人體可能存在一定的損害，臨床或科研研究中使用應考慮到磁性納米材料的不良影響。然而，關于磁性納米材料毒理學研究眾多，至今仍沒有統一定論。總之，從以上文獻中可發現(表1)，暴露于表面化學性質不同的SPIONs(裸露、COOH和NH2)后，不同的人類細胞類型(HCM、BE-2和HEK293T)顯示出不同程度的細胞毒性和基因表達模式[70]。

不同性狀的磁性納米材料對不同細胞在低劑量時沒有明顯毒性，并且可以抑制腫瘤細胞的活性，但急性暴露或長時間暴露或使用裸磁性納米材料時有明顯毒性。而表面涂層，如有機和無機聚合物肽、纖維連接蛋白和葡聚糖，可改善生物制品的親水性和保護生物制品免受損害。因此，為了減輕磁性納米材料的毒性，可以考慮對其進行修飾。在小鼠和兔的實驗中，磁性納米顆粒易聚集于肝臟和腎臟等富含吞噬細胞的組織和器官，會導致病理學改變，但多數實驗未見明顯毒性。

秀麗隱桿線蟲為具有神經細胞的多細胞生物[68]，其結構簡單、易于觀察，且與人類的多種生命活動調控機制相似，因此，秀麗隱桿線蟲作為模式生物，用于磁性納米材料毒性的研究近幾年越來越多。從現有研究中可以發現，磁性納米材料的確存在毒性，但是材料濃度、暴露方式、時間和實驗對象的不同等，會有不同的結果。并且，因為磁性納米材料的修飾物多種多樣，不同文獻實驗內容有所差異，難以作出比較。磁性納米材料的不同濃度、不同修飾物和不同接觸方式在何種條件下對人體造成傷害？磁性納米材料影響人體的方式及作用機制是什么？而秀麗隱桿線蟲其體內的多種生物機制與人體有很多相似之處，以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，根據實驗結果推測磁性納米材料對人體的影響，可靠性更強。因此，利用秀麗隱桿線蟲研究磁性納米材料的毒性，是一個比較好的選擇。

表1 磁性納米顆粒對不同生物模型的毒性研究Table 1 Toxicity of magnetic nanoparticles (MNPs) to different biological models

續表1生物模型Model oganisms給藥方式和暴露時間Administration route and exposure time磁性納米顆粒類型Types of magnetic nanoparticles表面修飾物Surface chemistry大小/nmSize/nm主要觀察Major observations主要結果Major results參考文獻ReferencesARPE-19細胞ARPE-19 cell37 ℃,6、12、72 hMNPs含有氨基的有機層Organic layer containing amino30細胞毒性、基因毒性Cytotoxicity, genotoxicityDNA損傷,高濃度細胞壞死DNA damage, high concentration cell necrosis[43]細胞和新西蘭兔HUVECs cell and New Zealand rabbits靜脈注射,37 ℃、4 hIntravenous injection, 37 ℃, 4 hFe2+Zn2+、Co2+8細胞活性、兔體內影響Cytoactive, in vivoeffects in rabbits降低細胞存活率,兔體內組織毒性Reduce cell survival, tissue toxicity in rabbits[44]HL-7720細胞HL-7720 cell37 ℃、24 hFe3O4無Free8細胞毒性Cytotoxicity細胞活性降低,DNA損傷Decreased cell activity, DNA damage[45]HL-7720細胞HL-7720 cell37 ℃、36 hFe3O4TiO220～25細胞毒性Cytotoxicity可誘導氧化應激,潛在致癌Induce oxidative stress, possibly carcinogenic[46]Wistar大鼠Wistar rats鼻內注射,7 dNasal injection, 7 dFe2O3無Free30體內影響in vivo effects激素升高但無影響Hormone elevation but no effect[50]大鼠Rats尾靜脈、24 hCaudal vein injection, 24 hFe3O4無Free9蛋白表達的影響Effect on protein expression網格蛋白表達增強Enhance expression of trellis protein[47]ICR小鼠ICR mice灌胃、14 dGavage, 14 dFe3O4油酸鈉Sodium oleate15急性毒性Acute toxicity肝脾損害Liver and spleen injury[19]小鼠、HECa-10細胞Mice, HECa-10 cell37 ℃、24 hFe碳、羧甲基纖維素Carbon, carboxymethyl cellulose47～56細胞毒性Cytotoxicity線粒體、細胞膜毒性Mitochondria, cytomembrane toxicity[48]小鼠Mice尾靜脈Caudal vein injectionFe2O3谷氨酸、放射性標記Glutamic acid, radioactive labeling15藥代動力學影響Pharmacokinetic effect作用于肝脾,無細胞毒性Action on liver and spleen, no cytotoxicity[49]小鼠Mice灌胃、30 dGavage, 30 dFe2+Zn2+11.0±0.5肺毒性作用Pulmonary toxicity輕微炎癥反應Mild inflammatory reaction[51]家兔Rabbits耳緣靜脈Marginal auricular vein injectionFe3O4無Free9體內影響、生化改變In vivo influence, biochemical changes聚集于肝脾,無明顯改變Gathered in the liver and spleen, without obvious change[54]L4線蟲L4 C. elegans20 ℃、7 d氧化鐵Iron oxide無Free36衰老、年齡Aging, age壽命縮短Loss of life[55]L4線蟲L4 C. elegans20 ℃、24 hFe3O4CMC11.5±0.7生殖毒性Genotoxicity多代生殖毒性Multigeneration reproductive toxicity[66]

注： SPIONs表示λ-Fe2O3超順磁性氧化鐵納米顆粒，IONP表示氧化鐵納米顆粒；AT表示黃肉楠堿，PEG表示聚乙二醇，PVP表示聚乙烯醇，CMC表示羧甲基纖維素。

Note: SPIONs stands for superparamagnetic iron oxide nanoparticles of λ-Fe2O3; IONP stands for iron oxide nanoparticles; AT stands for actein; PEG stands for polyethylene glycol; PVP stands for polyvinyl alcohol; CMC stands for carboxymethyl cellulose.