不同水稻品種對鎘積累的差異及其與鎘亞細胞分布的關(guān)系

嚴勛，唐杰，李冰，王昌全，徐強，蔡欣，付鑠嵐

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都 611130

近年來，重金屬在世界上很多地方(包括中國)已造成嚴重的土壤污染問題[1]。Cd每年大約有3萬t排放到環(huán)境中，其中約13 000 t來源于人類活動，如發(fā)電站、供暖系統(tǒng)、金屬加工業(yè)、垃圾焚燒爐、城市交通、水泥廠和農(nóng)業(yè)磷肥的施用等[2]。Cd比較容易被植物吸收并積累，當植物體內(nèi)積累過量Cd后，會對植物自身產(chǎn)生嚴重的毒害作用，而Cd最終也會隨食物鏈進入人體，對人體造成嚴重危害，威脅人類健康[3]。水稻是世界上主要的糧食作物，且易于積累Cd[4]，其根系對Cd有較強的吸收能力，并通過木質(zhì)部將其轉(zhuǎn)運到地上部最后積累于籽粒中[5]。因此，在糧食安全生產(chǎn)問題上，含Cd大米將對人類健康造成嚴重的安全隱患。

不同水稻品種對Cd吸收和積累存在差異[6]。研究表明，在Cd脅迫下，高積累品種能夠更多地往地上部轉(zhuǎn)運Cd[7]，低積累品種能夠合成更多的非蛋白質(zhì)巰基和谷胱甘肽等物質(zhì)，從而限制Cd的遷移，而陽離子態(tài)Cd在高積累品種中含量更高[8-9]。OsNramp5和OsHMA2與Cd的吸收和轉(zhuǎn)運相關(guān)，OsHMA3與Cd的液泡區(qū)隔相關(guān)[10-11]，研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫能顯著提升OsNramp5和OsHMA2在高積累品種中的表達量，而OsHMA3在低積累品種中的表達量更高[12]。這些不同水稻品種在Cd脅迫下的生理差異導(dǎo)致了不同水稻品種對Cd吸收積累的差異。

植物亞細胞組分中細胞壁對于重金屬沉降起著重要作用[13]，當植物細胞壁上的重金屬結(jié)合位點飽和時，細胞內(nèi)的重金屬會與大量的有機配位體結(jié)合形成穩(wěn)定態(tài)的螯合物，并被轉(zhuǎn)運至液泡中儲藏，降低細胞質(zhì)中自由重金屬離子的濃度[14]。現(xiàn)有研究表明，重金屬的亞細胞分布，有利于闡述重金屬在植物體內(nèi)的差異特征[15-17]，關(guān)于Cd在不同水稻品種亞細胞中的分布研究，大多單一地統(tǒng)計水稻組織亞細胞組分中的Cd含量[18-19]，從微觀層次闡述Cd在不同水稻品種各組織部位亞細胞分布的差異，及其與Cd轉(zhuǎn)運關(guān)系的報道結(jié)論也不統(tǒng)一。而且大部分研究僅以單一品種水稻為研究對象，具有局限性，關(guān)于比較不同基因型水稻差異的相關(guān)文章相對較少。因此，本研究通過盆栽試驗，比較不同水稻品種各組織中Cd的分配規(guī)律及其與Cd亞細胞分布特征的關(guān)系，為培育Cd低積累水稻品種和水稻安全生產(chǎn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試水稻材料為前期篩選得到的籽粒Cd低積累水稻品種越冬稻、R1088(下面統(tǒng)一簡稱“低積累品種”)和籽粒Cd高積累水稻品種IR34582、太粳558(下面統(tǒng)一簡稱“高積累品種”)，其生育期基本一致(150 d)，均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所提供。

供試土壤為水耕人為土，采自成都市溫江區(qū)公平鎮(zhèn)惠合村(103.86845E, 30.72228N)，其基本理化性質(zhì)如表1所示。

1.2 試驗設(shè)計

試驗于2016年4月至2016年10月在四川農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室內(nèi)進行，光、水、氣和熱等環(huán)境條件均為自然狀態(tài)，無人為干擾。挑選顆粒飽滿的水稻種子用30%的H2O2溶液消毒30 min，蒸餾水洗凈后加0.1%的NaClO溶液殺菌20 h，再用37 ℃蒸餾水在恒溫培養(yǎng)箱進行催芽處理48 h。選取露白的種子置于放有濕潤石英砂的育苗盤中培養(yǎng)，待水稻種子出苗后，用1/4濃度的營養(yǎng)液進行澆灌培養(yǎng)，營養(yǎng)液的配制參照李冰等[20]的方法。在幼苗移栽前35 d對供試土壤作加Cd(CdCl2·2.5H2O)陳化處理，設(shè)置3個Cd處理水平：Cd0(不加Cd)、Cd5(5 mg·kg-1)和Cd25(25 mg·kg-1)，每個處理設(shè)3個重復(fù)，4個水稻材料共計36桶，供試土壤裝在10 L的塑料桶中，每桶裝7 kg(干土重)。待幼苗三葉一心時取長勢一致、健康的水稻幼苗插秧移栽至培育好的Cd污染土壤中。氮、磷和鉀肥分別選用尿素、磷酸二氫鉀和氯化鉀，用量分別為200、100和105 mg·kg-1土，全部的磷、鉀肥和30%的氮肥在移栽前一天作為基肥施入，剩余氮肥在水稻分蘗期(30%)和拔節(jié)期(40%)分2次進行追施，隨后按照常規(guī)管理，做好防治病蟲害工作。于水稻成熟期收獲樣品進行室內(nèi)分析測定。

表1 供試土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physicochemical properties of the tested soil

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤基本理化性質(zhì)測定

土壤基本理化性質(zhì)測定參照張甘霖和龔子同[21]的方法。

1.3.2 Cd在水稻植株各器官的亞細胞分布

亞細胞的分離參照Liu等[22]的方法。先將水稻根、莖、葉鞘和葉分別取樣置于不同的分類袋中，然后在分類袋中稱取混合均勻的根、莖、葉鞘和葉1.0 g鮮樣，加入20 mL提取液后，在研缽中冰浴研磨成勻漿，提取液組成為50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)+250 mmol·L-1蔗糖+1.0 mmol·L-1二硫赤蘚糖醇(DTE)+5.0 mmol·L-1抗壞血酸+1.0%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)。勻漿液首先經(jīng)240 μm尼龍布過濾，殘渣為細胞壁部分(F1)；濾液經(jīng)高速冷凍離心機(Model ALLEGRA-64R, Beckman Coulter. Inc. USA)4 ℃下以10 000 g離心30 min，沉淀部分為細胞器部分(F2)；取上清液再次經(jīng)高速冷凍離心機4 ℃下以50 000 g離心30 min，沉淀部分為細胞膜部分(F3)，上清液為可溶部分(F4)(主要包括細胞質(zhì)、有機物、無機離子和液泡內(nèi)的大分子)。所有的化學(xué)試劑均采用優(yōu)級純，購自成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.3.3 Cd含量測定

取細胞壁(F1)、細胞器(F2)和細胞膜(F3)部分在70 ℃下烘干的樣品，以及水稻成熟期的根及地上部粉碎樣共0.3 g，加10 mL HNO3-HClO4(4:1，V/V)混合液消化24 h，在高溫條件下消煮至澄清并用去離子水過濾到50 mL容量瓶中定容，用原子吸收分光光度計(Analyst 800, Perkin Elmer, USA)測定Cd含量。以國家標準物質(zhì)GSB-22(Cd含量為(0.018±0.002) mg·kg-1)為內(nèi)標控制分析質(zhì)量。所有的化學(xué)試劑均采用優(yōu)級純，購自成都科隆化學(xué)品有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

運用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，采用LSD檢驗方法進行差異顯著性分析(P<0.05)；運用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理與圖表制作。

Cd轉(zhuǎn)運效率：TFA-B=B器官中Cd含量/A器官中Cd含量×100%[23-24]。

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)進行不同水稻品種各組織間轉(zhuǎn)運效率與亞細胞分布比例的相關(guān)性分析，其中，TF根-莖與細胞壁Cd分配比例相關(guān)性分析即為TF根-莖與根中細胞壁Cd分配比例相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 不同濃度Cd處理中水稻各組織Cd含量及其轉(zhuǎn)運效率

不同濃度Cd處理中水稻各組織部位Cd含量情況如表2所示。水稻各組織部位Cd含量均隨Cd處理濃度的增加而增加，Cd主要集中于根系，低積累品種根系Cd所占比例約83%，而高積累品種根系Cd所占比例約65%，各組織部位Cd含量依次為根系﹥莖﹥?nèi)~鞘﹥?nèi)~﹥糙米。Cd5處理組中，低積累品種越冬稻和R1088根系Cd含量分別為27.2和26.5 mg·kg-1，顯著高于高積累品種(P<0.05)，且低積累品種越冬稻和R1088糙米Cd含量分別為0.10和0.07 mg·kg-1，均低于國家標準(GB 2762—2012)的糙米Cd含量限值0.2 mg·kg-1；Cd25處理中，低積累品種越冬稻和R1088根系Cd含量分別為78.5和75.4 mg·kg-1，顯著高于Cd高積累品種IR34582和太粳558(P<0.05)；然而，Cd5和Cd25處理中，低積累品種莖、葉鞘、葉和糙米Cd含量卻顯著低于高積累品種(P<0.05)。

表2 不同濃度Cd處理中水稻各組織Cd含量Table 2 Cd content in different tissues of rice under different levels of spiked cadmium

注：同列不同小寫字母表示不同水稻品種在同一Cd濃度條件(0、5和25 mg·kg-1)下在P<0.05上差異顯著；下同。

Note: Different small letters within one column mean different rice varieties in the same concentration of Cd (0, 5 and 25 mg·kg-1) showing significant differencebetween Cd treatments at the 0.05 level; the same as below.

不同濃度Cd處理中水稻各組織Cd轉(zhuǎn)運效率情況如由圖1所示。在Cd0處理時，高、低積累水稻各組織間Cd轉(zhuǎn)運效率無顯著差異；在5 mg·kg-1和25 mg·kg-1Cd脅迫下，低積累品種TF根-莖、TF莖-籽粒、TF葉鞘-籽粒和TF葉-籽粒均顯著低于高積累品種。

2.2 不同水稻品種根系Cd亞細胞分布及其分配比例

不同水稻品種根系Cd亞細胞分布及其分配比例如表3所示。Cd脅迫下，低積累品種根F1、F2、F3和F4中Cd含量均顯著高于高積累品種；根中亞細胞組分Cd分配主要集中于F1和F4(大約75%以上)，Cd分配比例依次為F1﹥F4﹥F3﹥F2；低積累品種越冬稻和R1088根F1分配比例均顯著高于高積累品種IR34582和太粳558，而根F4分配比例卻均顯著低于高積累品種IR34582和太粳558；Cd脅迫下，根F2和F3中Cd分配比例無顯著差異。

表3 不同水稻品種根中Cd亞細胞分布及其分配比例Table 3 Subcellular distribution of Cd in the roots of different rice cultivars

2.3 不同水稻品種莖中Cd亞細胞分布及其分配比例

不同水稻品種莖中Cd亞細胞分布及其分配比例如表4所示。Cd脅迫下，低積累品種莖F1、F2、F3和F4中Cd含量均顯著低于高積累品種；莖中亞細胞組分Cd分配主要集中于F1和F4(大約75%以上)，Cd分配比例依次為F1﹥F4﹥F2﹥F3；低積累品種越冬稻和R1088莖F1分配比例均顯著高于高積累品種IR34582和太粳558，而莖F4分配比例卻均顯著低于高積累品種IR34582和太粳558；Cd脅迫下，莖F2和F3中Cd分配比例無顯著差異。

表4 不同水稻品種莖中Cd亞細胞分布及其分配比例Table 4 Subcellular distribution of Cd in the stems of different rice cultivars

圖1 不同濃度Cd處理中水稻各組織間Cd轉(zhuǎn)運效率注：不同小寫字母表示在同一Cd濃度條件(5和25 mg·kg-1)下不同水稻品種各組織間轉(zhuǎn)運效率在P<0.05上差異顯著，TFR-S表示TF根-莖，TFS-B表示TF莖-糙米，TFLS-B表示TF葉鞘-糙米，TFL-B表示TF葉-糙米。Fig. 1 Cd transport efficiency among rice tissues under different levels of Cd concentrationNote: Different small letters mean the translocation efficiency of different rice varieties in the same concentration of Cd (5 and 25 mg·kg-1) showing significant difference between Cd treatments at 0.05 levels. TFR-S means TFroot-stem, TFS-B means TFstem-brown rice, TFLS-B means TFleaf sheath-brown rice, TFL-B means TFleaf -brown rice.

2.4 不同水稻品種葉鞘Cd亞細胞分布及其分配比例

不同水稻品種葉鞘Cd亞細胞分布及其分配比例如表5所示。Cd脅迫下，低積累品種葉鞘F1、F2、F3和F4中Cd含量均顯著低于高積累品種；葉鞘亞細胞組分Cd分配主要集中于F1和F4(大約70%以上)，Cd分配比例依次為F1﹥F4﹥F2﹥F3；低積累品種葉鞘中F1、F2、F3和F4中Cd分配比例與高積累品種無顯著差異。

表5 不同水稻品種葉鞘中Cd亞細胞分布及其分配比例Table 5 Subcellular distribution of Cd in the sheaths of different rice cultivars

2.5 不同水稻品種葉中Cd亞細胞分布及其分配比例

不同水稻品種葉中Cd亞細胞分布及其分配比例如表6所示。Cd脅迫下，低積累品種葉F1、F2、F3F3和F4中Cd含量均顯著低于高積累品種；葉中亞細胞組分Cd分配主要集中于F1和F4(大約75%以上)，Cd分配比例依次為F1﹥F4﹥F2﹥F3；低積累品種葉中F1、F2、F3和F4中Cd分配比例與高積累品種無顯著差異。

表6 不同水稻品種葉中Cd亞細胞分布及其分配比例Table 6 Subcellular distribution of Cd in the leaves of different rice cultivars

2.6 不同水稻品種各組織間轉(zhuǎn)運效率與亞細胞分布比例的相關(guān)性分析

不同水稻品種各組織間轉(zhuǎn)運效率與Cd亞細胞分布比例的相關(guān)性分析如表7所示。TF根-莖與細胞壁(F1)Cd分配比例相關(guān)性分析即為TF根-莖與根中細胞壁(F1)的Cd分配比例相關(guān)性分析。

在Cd5中，TF根-莖和TF莖-糙米均與F1分配比例成顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.893和-0.974(P<0.01)，TF根-莖和TF莖-糙米均與F4分配比例成顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.869和0.979(P<0.01)；在Cd25中，TF根-莖和TF莖-糙米均與F1分配比例成顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.852和-0.934(P<0.01)。TF根-莖和TF莖-糙米均與F4分配比例成顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.887和0.934(P<0.01)。

Cd脅迫下，根中F1、F4均與TF根-莖相關(guān)性顯著；莖中F1、F4均與TF莖-糙米相關(guān)性顯著；而葉鞘中F1、F4均與TF葉鞘-糙米相關(guān)性不顯著；葉中F1、F4均與TF葉-糙米相關(guān)性不顯著。

在Cd5中，TF根-莖與F2分配比例成顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.704(P<0.05)，TF根-莖與F3分配比例成顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.711(P<0.01)，而在Cd25中相關(guān)性不顯著；在Cd5中，TF葉鞘-糙米與F4分配比例成顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.660(P<0.05)，而在Cd25中相關(guān)性不顯著。

3 討論(Discussion)

水稻不同器官對Cd的吸收能力存在很大差異，其中以根吸收富集Cd的能力最強，一般以根>莖葉>籽粒的順序遞減[25]。有研究表明，Cd脅迫下，不同Cd積累特性水稻根系Cd含量均顯著高于地上部[26-27]。本研究與前人研究結(jié)果一致，Cd脅迫下，Cd大多數(shù)積累于根系部位，低積累品種可以積累80%以上的Cd，高積累品種可以積累60%以上的Cd。這說明根系的滯留作用是植物應(yīng)對Cd脅迫的重要機制[28-29]。

表7 不同水稻品種各組織間轉(zhuǎn)運效率與Cd亞細胞分布比例的相關(guān)系數(shù)(r)Table 7 Correlation coefficient (r) between the subcellular distribution ratios of Cd and translocation factors (TF) of Cd in rice

注：“*”代表相關(guān)性在P<0.05水平上顯著；“**”代表相關(guān)性在P<0.01水平上顯著。

Note: “*” significance atP<0.05; “**” significance atP<0.01.

根系對Cd的吸收轉(zhuǎn)運、地上部對Cd的分配決定了籽粒Cd的積累。轉(zhuǎn)運效率反映Cd在水稻組織中的轉(zhuǎn)運能力，轉(zhuǎn)運效率越大，其在組織間的轉(zhuǎn)運能力就越強，對籽粒Cd積累的影響就越大[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，高積累水稻品種根系、莖和葉Cd含量均高于低積累水稻品種[30]。本研究中，Cd脅迫下高積累水稻品種根系Cd含量顯著低于低積累水稻品種，而地上部各部位Cd含量卻均顯著高于低積累水稻品種。這可能與不同水稻品種間本身的遺傳特性相關(guān)[31-32]。已有研究表明，高積累品種根系往地上部轉(zhuǎn)運Cd的效率高于低積累水稻品種[30,33]，本研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果類似，低積累品種往地上部轉(zhuǎn)運Cd的能力顯著低于高積累品種，越冬稻和R1088轉(zhuǎn)運效率TF根-莖只有10%左右，而IR3482和太粳558高達20%以上；同時，越冬稻和R1088地上部往糙米轉(zhuǎn)運Cd的能力也均顯著低于IR3482和太粳558。相比低積累品種，高積累品種更多地往地上部轉(zhuǎn)運Cd是導(dǎo)致不同Cd積累特性的重要機理[34]。

在亞細胞水平上能深入研究水稻對Cd的吸收轉(zhuǎn)運、積累和耐受機制[35]。細胞壁沉降Cd以及細胞內(nèi)的區(qū)隔化作用是植物體內(nèi)部鈍化Cd的2個重要過程[36]，細胞壁是保護水稻免受Cd毒害的第一道屏障，其上的纖維、半纖維和果膠等物質(zhì)能阻止Cd進入原生質(zhì)層[37]，因此，不同水稻品種各組織亞細胞組分中，細胞壁的Cd含量及分配比例均最高。當少量Cd進入植物細胞原生質(zhì)層后，只有少部分會以游離態(tài)的形式存在于細胞中，大部分會與一些小分子化合物以螯合態(tài)的形式存在于可溶部分中[38]，所以Cd大部分存在于細胞壁和可溶部分中[30,39]。目前，關(guān)于Cd在亞細胞中的分布仍存在爭議，張路等[40]研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下，水稻材料中Cd的亞細胞分布表現(xiàn)為可溶部分>細胞壁>細胞器，而另有研究發(fā)現(xiàn)，Cd的亞細胞分布表現(xiàn)為細胞壁>可溶部分>細胞器[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下，不同基因型水稻同一品種各組織Cd亞細胞分配比例均表現(xiàn)為細胞壁>可溶部分>細胞膜、細胞器，對比高、低積累水稻品種間根和莖亞細胞組分Cd分配比例發(fā)現(xiàn)，越冬稻和R1088細胞壁分配比例均顯著高于IR3482和太粳558；而越冬稻和R1088可溶部分分配比例卻均顯著低于IR3482和太粳558；在葉鞘和葉中，兩者分配比例在不同品種之間無顯著差異，這與Liu等[22]的研究結(jié)果一致。這些研究結(jié)果的差異可能是由于實驗處理以及栽培品種的不同導(dǎo)致[40]，而高、低積累水稻品種間根和莖亞細胞組分Cd分配比例的不同，可能是導(dǎo)致它們從根部往地上部轉(zhuǎn)運Cd以及從莖往糙米轉(zhuǎn)運Cd的能力存在差異的直接原因。

亞細胞組分細胞壁在水稻Cd沉積中起主要作用，并抑制Cd從根到莖的轉(zhuǎn)運[41]，可溶部分則是水稻將Cd轉(zhuǎn)運到籽粒中主要的Cd亞細胞池[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，高、低積累品種間，根與莖的細胞壁和可溶部分Cd分配比例存在較大差異。通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下，TF根-莖和TF莖-糙米與細胞壁中Cd分配比例均成顯著負相關(guān)，而TF根-莖和TF莖-糙米與可溶部分分配比例均呈顯著正相關(guān)。由此可以推知，根和莖中細胞壁和可溶部分Cd的亞細胞分布是影響Cd從根部轉(zhuǎn)運到地上部以及莖到籽粒的重要因素。一定濃度Cd脅迫下(Cd5時)，TF根-莖與根中細胞器和細胞膜分配比例存在顯著相關(guān)性，而在Cd25時相關(guān)性不顯著，TF葉鞘-糙米與可溶部分分配比例也存在相同關(guān)系，這可能因為Cd超過一定范圍后打破了植物對Cd的耐受機制[43]，影響了Cd在水稻中的吸收轉(zhuǎn)運所致。

不同水稻品種對Cd的吸收、轉(zhuǎn)運和分配存在差異，不僅僅是亞細胞組分Cd分配比例不同所致。有研究發(fā)現(xiàn)，非蛋白巰基(NPT)和谷胱甘肽(GSH)是影響Cd遷移的重要物質(zhì)[9]，水稻OsHMA2等基因編碼的陽離子轉(zhuǎn)運蛋白能夠攜帶Cd2+從根系向地上部運輸[44]，水稻在成熟過程中，OsPCR1與Cd向籽粒的運輸密切相關(guān)[45]，其具體生理、分子機理有待進一步研究。

本文得出的主要結(jié)論如下：

(1)在不同水稻品種中，Cd大部分積累于水稻根系中；低積累品種根系Cd含量高于高積累品種，而地上部各組織部位Cd含量均低于高積累品種；高積累品種往地上部轉(zhuǎn)運Cd的能力更強。

(2)不同基因型水稻品種各組織部位Cd的亞細胞分布存在差異，低積累品種根和莖中細胞壁Cd分配比例高于高積累品種，而可溶部分Cd分配比例卻低于高積累品種。這說明細胞壁和可溶部分在Cd遷移過程中起著重要作用。

(3)在高、低積累品種中，TF根-莖和TF莖-糙米均與細胞壁Cd分配比例成顯著負相關(guān)關(guān)系，而與可溶部分成顯著正相關(guān)關(guān)系。這說明細胞壁具有較強的Cd固持能力，是限制Cd遷移的重要物質(zhì)；而Cd的遷移是伴隨可溶部分一同進行，可溶部分Cd分配比例越高，Cd遷移能力越強。

致謝：感謝四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所李健博士在實驗中提供的幫助。