葉菌唑對斑馬魚的急性毒性及生物富集效應

李如美，戴爭，王維，張霞，郇恒尚，李丹丹，高宗軍,*

1. 山東省農業科學院植物保護研究所/山東省植物病毒學重點實驗室，濟南 250100 2. 南京南農農藥科技發展有限公司，南京 210095

隨著農藥的廣泛應用，其對生態環境的破壞也日趨嚴重，農藥污染問題也已經成為全人類廣泛關注的重大環境問題。農藥環境安全性評價工作已成為農藥科學合理施用的基礎，同時對保障生態環境安全具有重要的作用[1]。農藥在田間施用時，可以通過多種途徑進入水生環境，引起水資源污染、水生生態系統破壞和食品安全等一系列問題[2]。魚類作為生態系統中的重要生物，同時又是人類的主要食物，農藥對水生生物的急性毒性和生物富集性與農藥的合理施用密切相關，因此，農藥對魚類的毒性評價工作一直是農藥環境評價的重點[3]。

葉菌唑(metconazole)作為一種新型三唑類廣譜內吸性殺菌劑，可有效防治小麥赤霉病、小麥白粉病以及小麥銹病等禾谷類作物病害，在小麥發病的關鍵期，化學防治是控制小麥病變的重要手段[4-6]。小麥作為重要的糧食作物，在中國人餐桌上的呈現方式多種多樣。因此，評價葉菌唑對非靶標生物的毒性備受關注。目前，關于葉菌唑的研究多集中在小麥病害防治方面[7-8]，但對哺乳動物和非靶標生物毒性作用的研究還相對較少，本研究開展了葉菌唑原藥生物富集效應和對斑馬魚(Brachydaniorerio)急性毒性的研究，為更全面評價葉菌唑在環境中的安全性提供依據，以減少農藥使用過程中的環境危害。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗材料

95%葉菌唑原藥購自江蘇耕耘化學有限公司；助溶劑丙酮購自(分析純)天津市富宇精細化工有限公司。

斑馬魚(Brachydaniorerio)購買于濟南夢幻水景商貿有限公司，染毒前在試驗條件下馴化7 d。

試驗用水為存放并經活性炭去氯處理24 h以上的自來水。水質硬度為10～250 mg·L-1(以碳酸鈣計)，pH為6.0～8.5，并且試驗期間變化量在±0.5之間，溶解氧保持在試驗溫度下飽和值的60%；室內溫度為(25±1) ℃。

HQd40便攜式pH計(梅特勒-托利多，美國)、HQd40便攜式溶解氧測定儀(梅特勒-托利多，美國)、YD-300水質硬度計(上海三信儀表廠，中國)、Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，美國)、Z326K高速冷凍離心機(HERMLE，德國)、SQP百分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司，德國)、BSA224S-CW萬分之一電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司，德國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 斑馬魚急性毒性試驗

本試驗依據《化學農藥環境安全評價試驗準則》第12部分：魚類急性毒性試驗[9]，采用半靜態法研究葉菌唑原藥對斑馬魚的急性毒性效應。設置5個濃度組，葉菌唑濃度分別為3.18、3.50、3.85、4.25和4.66 mg·L-1，并設空白對照組和助溶劑對照組。將試驗用魚放入按濃度配制的水溶液中，每缸5 L水溶液，每組10尾魚，并保證各組大小一致，每24 h更換一次試驗藥液，測定溶解氧與pH，記錄96 h每個魚缸中斑馬魚的死亡情況。

1.2.2 斑馬魚富集試驗

參照《化學農藥環境安全評價試驗準則》第7部分：生物富集試驗[10]，采用半靜態法對斑馬魚生物富集效應進行研究。根據95%葉菌唑原藥對斑馬魚急性毒性的96 h-LC50，以其1/100(3.90×10-2mg·L-1)和1/10(0.39 mg·L-1)設置2個處理組濃度，同時設空白對照和溶劑對照。每個處理2次重復，每次重復40條魚。8 d內每24 h更換試驗藥液，并于0、24、48、96、144和192 h分別從各處理中取水樣與魚樣，對水樣與魚樣中供試物含量以及pH、水溫和溶解氧含量進行測定，同時觀察記錄試驗魚中毒癥狀和死亡數。

1.2.3 儀器分析方法

Agilent1260高效液相色譜儀檢測條件：紫外檢測器的檢測波長為220 nm；流動相為甲醇：水(75∶25，V∶V)，流速為1 mL·min-1；進樣體積為20 μL；柱溫為30 ℃，色譜柱為SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。

1.2.4 樣品前處理

水樣：取20 mL水樣于分液漏斗中，加入20 mL二氯甲烷，萃取2次，取下層液體于雞心瓶中，40 ℃旋轉蒸發近干，甲醇溶解定容至1 mL，過0.22 μm有機濾膜，待測。

魚樣：將每個魚缸中的魚用0.8% NaCl溶液清洗，于離心管中稱重，加入10 mL乙腈，勻漿2 min，按每1 g樣品加1 g無水硫酸鈉。超聲15 min，6 000 r·min-1離心10 min，取上清液于雞心瓶中。殘渣中再加入10 mL乙腈，重復提取一次，合并上清液。50 ℃旋轉蒸發近干，甲醇溶解定容至5 mL。用5 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶液(V(二氯甲烷)：V(甲醇)=95∶5)活化弗羅里硅土小柱，將定容的5 mL溶液全部加入到柱頂進行凈化，用5 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶液(V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=95∶5)洗脫2次，收集洗脫液，50 ℃旋轉蒸發近干，甲醇溶解定容至1 mL，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.2.5 數據處理

標準曲線的繪制：用甲醇配制0.10、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 mg·L-1葉菌唑系列標準工作溶液按上述條件進樣分析，以濃度-峰面積繪制葉菌唑標準曲線，其回歸方程為y=44.903x+1.4488 (R2=0.9999)。結果表明，葉菌唑在0.10～10.00 mg·L-1濃度范圍內線性良好。

水樣中添加回收率測定：分別向試驗用水中添加試驗農藥標準品，使其濃度為0.39和0.039 mg·L-1，每個濃度設置5個重復，采用上述前處理和儀器分析方法，測定試驗農藥濃度。平均回收率為90.32%～90.96%，相對標準偏差(RSD)為2.25%～3.54%。

魚樣中添加回收率測定：在魚中添加葉菌唑標準溶液，設0.39 mg·L-1和3.9 mg·L-12個添加濃度，每個濃度設5個平行。平均回收率為91.63%～96.17%，RSD為3.85%～4.84%。

統計分析：斑馬魚急性毒性試驗96 h-LC50值以及95%的置信限由統計軟件SPSS 18.0計算而得。生物富集系數(BCF)計算公式為BCF=Cfs/Cws，其中，Cfs為平衡時魚體內的供試物含量，Cws為平衡時水體內的供試物含量。依據《化學農藥環境安全評價試驗準則》中的標準，判斷戊唑醇對斑馬魚的毒性等級與富集效應等級。

2 結果(Results)

半靜態試驗結果顯示，試驗過程中空白對照組以及助劑組的斑馬魚與試驗開始時相比無明顯變化。95%葉菌唑原藥對斑馬魚急性毒性的96 h-LC50為3.89 mg·L-1(表1)。95%葉菌唑原藥96 h-LC50的1/100試驗處理組中，試驗結束時(192 h)，魚體中葉菌唑含量尚未達到平衡，斑馬魚對葉菌唑的生物富集系數(BCF8d)為26.2(表2)。95%葉菌唑原藥96 h-LC50的1/10試驗處理組中，4 d時水體及魚體中葉菌唑含量達到平衡，斑馬魚對葉菌唑的生物富集系數(BCF)為53.3(表3)。

表1 95%葉菌唑對斑馬魚的致死率Table 1 The mortality rate of Brachydanio rerio induced by 95% metconazole

表2 95%葉菌唑原藥在斑馬魚體中的生物富集性(葉菌唑溶液初始濃度為0.039 mg·L-1)Table 2 The bioconcentration of 95% metconazole in Brachydanio rerio (the original concentration of metconazole is 0.039 mg·L-1)

表3 95%葉菌唑原藥在斑馬魚體中的生物富集性(葉菌唑溶液初始濃度為0.39 mg·L-1)Table 3 The bioconcentration of 95% metconazole in Brachydanio rerio (the original concentration of metconazole is 0.39 mg·L-1)

3 討論(Discussion)

溶劑和助劑本身會對魚類造成毒性傷害，因此，在農藥對魚類毒性試驗中應該盡量避免[11]。本研究選用的助劑為丙酮，急性毒性試驗和生物富集試驗的溶劑對照組中均未觀察到斑馬魚死亡和異常行為，說明丙酮=的影響可以忽略不計。

魚類生物富集試驗對評價農藥的環境行為及其慢性危害有十分重要的意義[12]。葉菌唑生物富集試驗結果表明，95%葉菌唑原藥96 h-LC50的1/100試驗處理中，斑馬魚對葉菌唑的生物富集系數(BCF8d)為26.2，95%葉菌唑原藥96 h-LC50的1/10試驗處理中，斑馬魚對葉菌唑的生物富集系數(BCF)為53.3，依據《化學農藥環境安全評價試驗準則》[11-12]判斷為中等富集性。農藥的水溶性和分配系數等與其生物富集性有關聯，葉菌唑原藥微溶于水，正辛醇-水分配系數較高，因此，其在魚體內富集作用較強[13]。

本試驗結果表明，葉菌唑在斑馬魚體內屬于中等富集性農藥。因此，田間施用葉菌唑時，需特別注意其施用量、使用范圍和使用方法，應盡量避免其在水邊使用以減少對魚類的危害。此外，為了更加系統準確地評價葉菌唑的環境安全性，還需進行其他非靶標生物的毒性試驗以及環境歸趨試驗等[14-15]。