廣州市某A2/O工藝城鎮污水處理廠出水對大型溞的生殖毒性作用

劉蕓，胡小英，趙旭，易皓，溫勇，胡國成，王煒

生態環境部華南環境科學研究所，廣州 510655

城市污水處理廠廢水中存在雙酚A、烷基酚類、鄰苯二甲酸酯類、有機磷農藥、有機氯農藥以及雌激素類污染物[1-4]，這些物質已報道具有內分泌干擾效應，對水生生物的內分泌系統造成影響，其中有些物質還能夠通過改變雌雄激素水平而影響生物的繁殖能力。已有研究表明，城市污水與工業廢水已經成為環境水體中內分泌干擾物(EDC)的主要來源[5-7]。我國現行城市污水處理廠多采用A2/O處理工藝，對化學需氧量(COD)及氨氮具有較好的去除效果，但未對其中可能存在的毒害物質進行針對性的去除。

為了解污水處理廠廢水的生物毒性風險，馬梅等[8]利用T3發光菌檢測了某城市污水處理廠各處理段水樣的急性毒性效應，發現進入一級處理前水樣與處理結束后水樣均表現出發光抑制毒性；黃滿紅等[9]利用大型溞評價了上海市3家污水處理廠污水的急性毒性效應，發現進水具有一定的急性毒性，出水毒性降低；徐曉平等[10]發現，污水處理廠不同處理單元對污水毒性減弱能力存在差異，各處理工藝出水對大型溞仍然存在一定毒性，并且還認為有必要開展污水生物毒性測試來作為判斷廢水水質和污水處理工藝效果的一個補充檢驗方法。曹楠等[11]以生物遺傳毒性(UMU)和視黃酸受體(RAR)結合活性為指標，調查了城市污水的生物毒性，發現污水廠出水仍然普遍具有遺傳毒性，部分污水廠出水仍殘留RAR結合活性。隨著尾水排放，尾水中殘留的污染物可能對水生生物造成危害，因此，研究污水處理廠廢水的毒性風險具有重大意義。

大型溞(Daphniamagna)是一種對水質比較敏感的浮游動物，廣泛分布于淡水水域，它以浮游植物為食，又是魚類和大型無脊椎動物的餌料，是水生態系統中物質循環和能量流動的重要環節。同時，大型溞具有諸多優點，包括生活周期短，生長快，生殖量高，易培養，對水環境脅迫敏感等，故其被廣泛應用于各種毒性測試，已被證明能對重金屬[12-15]、藻毒素[16-17]和殺蟲劑[18-19]等多種毒性物質進行毒性表征。急性毒性實驗以死亡為終點主要檢測污染物的致死效應，而慢性毒性實驗可以更深入地了解有毒物質對生物的長期慢性影響，其中Dao等[16]利用Daphniamagna慢性毒性方法檢測了藍藻毒素的毒性效應，發現除了致死效應，低濃度下藍藻毒素能對大型溞的生長與生殖產生影響；李爽和徐鏡波[20]的研究表明，大型溞第一次產溞時間和產溞總量是表征生殖毒性最靈敏的生理參數。大型溞慢性毒性測試已被證明適用于地表水體的毒性評價[21]。美國環保局已將大型溞用于短期慢性毒性評價，并證實這是一種有效的評價方法[22]。

綜上，城鎮污水處理廠廢水毒性研究主要集中在急性毒性測試，慢性毒性測試的相關研究尚鮮見報道。利用大型溞開展城鎮污水處理廠不同污水處理單元出水毒性檢驗的研究有限[23]，本研究應用大型溞14 d慢性毒性測試方法對廣州地區某污水處理廠各工藝段出水進行毒性效應測試，了解城鎮污水處理廠污水毒性的變化規律，從綜合生物毒性角度評價現行污水處理廠A2/O工藝的脫毒減害效果。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗水樣

樣品采集瓶采用棕色帶塞細口玻璃瓶，樣品瓶經重鉻酸鉀洗液潤洗浸泡過夜，用自來水、蒸餾水洗凈后倒置晾干待用。采集的樣品運回實驗室后立即于4 ℃下保存，不添加任何溶劑及藥品，直接取出適量進行檢測。

樣品采集于廣州地區某污水處理廠，該污水處理廠采用A2/O工藝，于2012年12月一次性采集各工藝段出水(圖1)。

圖1 污水處理廠各工藝廢水樣品采樣點示意圖Fig. 1 Flow chart of wastewater sampling sites in sewage treatment plant

采集水樣水質常規指標檢測結果如表1所示，由表1可知，本次實驗所采集水樣在實驗過程中常規水質指標數值未發生顯著變化，說明在試驗周期內水樣性狀較為穩定。

1.2 受試生物與培養條件

大型溞(Daphniamagna)是一種濾食動物，以綠藻、細菌或酵母為食，成熟母溞體長3～5 mm，通體透明，可以通過體式顯微鏡直接觀察包括心跳和腸道等內部器官的情況。大型溞能分別進行孤雌生殖(外界環境適宜時)和有性生殖(外界環境惡化時)，并且產溞量高，所以大型溞適合作為生殖毒性研究的實驗對象。本研究所用大型溞來源于中國科學院生態環境研究中心，已在本實驗室穩定培養3代以上，在溫度(22±2) ℃光照培養箱中培養，光照周期16 h L∶8 h D，大型溞的餌料為3N-BBM培養基培養的小球藻藻液。

表1 水樣常規水質指標Table 1 Conventional water qualities of water sample

1.3 測試方法

本研究稀釋水采用ISO-6341(1996)推薦的人工重組水作為稀釋水和空白對照，具體組分如下：KCl 5.8 mg L-1，NaHCO364.8 mg L-1，MgSO4·7H2O 123 mg L-1，CaCl2·2H2O 294 mg L-1，pH 7.8±0.2。實驗選用同一母體后代、出生6～24 h、個體均勻的幼體為試驗用溞。懷卵母溞在產幼前轉移到不加食物的水體中，從而保證受試溞未進食。

1.3.1 48 h急性毒性測試

本研究急性毒性測試參考《水質物質對溞類(大型溞)急性毒性測定方法GB/T 13266—91》，實驗期間不喂食并及時移除死亡溞，每24 h更換80%試驗液。

具體實驗過程：試驗在100 mL結晶皿中進行，每個結晶皿加入50 mL水樣與1只幼溞，每個水樣的3個濃度組分別設置4個平行，每個平行3個重復，空白對照使用標準稀釋水，及時觀察并記錄大型溞運動與死亡情況，試驗期間不喂食，試驗溫度為(24±1) ℃。測試樣品濃度分別為：不稀釋時濃度(用100%表示)、稀釋2倍時濃度(用50%表示)和稀釋10倍時濃度(用10%表示)。

1.3.2 14 d慢性毒性測試

大型溞14 d慢性毒性實驗采用半靜態實驗，每隔24 h更換試驗溶液的80%并喂食相同濃度小球藻藻液。實驗在100 mL結晶皿中進行，每個結晶皿中加入50 mL水樣與1只幼溞。設置100%原樣品，半倍稀釋(50%)樣品和四倍稀釋(25%)樣品3個濃度組，標準稀釋水作為對照組，每組設置4個平行，每個平行3個重復。記錄大型溞的第一胎產溞時間、第一胎產溞數量、試驗期間產溞總數及母溞死亡數。試驗周期為14 d。

1.4 實驗質量控制

大型溞毒性測試中，對照組未出現不活動大型溞，實驗結束時水樣中溶解氧濃度必須大于或等于2 mg L-1，整個試驗過程溫度波動范圍不超過1 ℃。

1.5 數據統計與分析

采用SPSS V17.0軟件進行樣本檢驗統計，用單因素方差分析(ANOVA)法分析各試驗組與對照組大型溞第一胎產溞時間、第一胎產溞數量和試驗周期內母溞的總產溞數量之間的均值差異，所有圖片利用Excel繪制，P<0.05代表顯著性差異，用*表示。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 48 h急性毒性測試

48 h急性毒性實驗結果如表2所示，由表2可知，8個水樣的各個稀釋濃度樣品，均未在48 h內對大型溞活動產生顯著抑制作用，對大型溞急性毒性作用很弱。根據現場調研，該污水處理廠廢水來源主要為生活污水與少量印染廠廢水。已有研究顯示，生活污水與印染廢水對大型溞均為無顯著急性毒性效應或僅有弱急性毒性效應[8,24-25]，這與本研究結果基本一致。

2.2 第一胎產溞時間

試驗大型溞第一胎產溞時間如圖2所示，在空白對照組中，12只大型溞的第一胎平均產溞時間9.67 d，與實驗室日常養殖產溞時間以及文獻報道中正常產溞時間基本一致[24]，說明在本研究采用的實驗條件下，暴露組與對照組的差異是暴露樣品的作用導致的。

表2 48 h急性毒性測試結果Table 2 Results of 48 h acute toxicity

圖2 第一胎產溞時間注：*表示暴露組與空白組相比具有顯著差異性，P<0.05；下同。Fig. 2 Mean time to the production of the first broodNote: *indicates a significant difference between treatment and blank group, P<0.05; the same below.

將暴露組與對照組的第一胎產溞時間進行組間差異分析，結果顯示，從1#到5#樣品所有濃度組均與對照組出現顯著性差異，6#和8#樣品100%濃度組與對照組比較有顯著的組間差異，另外，7#樣品50%稀釋濃度組與對照組的產溞時間存在顯著差異(圖2)。

廢水經過細格柵和沉砂池處理后，僅僅除去了其中體積較大的雜物，而污水中具有毒性的化學物質并未得到處理，所以，1#和2#樣品暴露對大型溞存在顯著的毒性作用。根據工藝圖(圖1)顯示，3#樣品為污泥回流后第一個水樣，而市政污水處理設施中的污泥中含有如壬基酚等污染物能讓溞類首次產溞時間延后[26]，回流污泥中的毒性物質可能溶入水體，導致3#樣品暴露組與對照組產生顯著差異；經過厭氧池處理，4#樣品中仍存在對大型溞具有生殖毒性的物質；5#樣品為缺氧池出水與好氧池廢水回流后的混合物，仍顯示出明顯的生殖毒性，說明其中具有生殖毒性的物質未完全去除；6#樣品的50%與25%濃度組第一胎平均產溞時間早于對照組，且根據實驗記錄顯示(未在文中列出)，對照組中母溞最早在第9天開始產溞，廢水樣品中只有6#樣品的50%與25%濃度組有大型溞在第9天開始產溞，其余樣品均從暴露第10天才開始產溞，因此，廢水樣品總體呈現第一胎產溞時間推后的趨勢。這與張澤光等[24]報道的造紙廢水經傳統工藝處理后各工藝段出水均能延長大型溞第一胎產溞時間的結論基本一致。經好氧池處理后的6#樣品生殖毒性顯著降低，說明好氧池處理是主要去除生殖毒性物質的處理工藝。7#樣品為6#樣品經過了物理處理后樣品，二者未顯示明顯差異。最后經過紫外消毒后，8#樣品暴露也導致大型溞平均產溞時間有所推遲，8#水樣生殖毒性再次升高，可能是紫外消毒工藝過程讓處理水中的某些成分再次發生了變化，并產生了毒性物質所致。因此，從整個工藝過程分析可知，經過好氧池處理的出水對大型溞的生殖毒性作用減弱。

2.3 第一胎產溞數量

對大型溞第一胎產溞量進行了統計，結果如圖3所示。在100%原樣濃度組中，1#～5#暴露組大型溞第一胎產溞量與對照組相比均出現顯著提高，而7#暴露組第一胎產溞量顯著低于對照組；50%濃度樣品組中，1#、2#和6#暴露組第一胎產溞量仍顯著高于對照，但與100%濃度組相比產溞量有所降低；而7#樣品第一胎產溞量顯著低于對照。所有樣品25%稀釋濃度組與對照組相比，均無顯著性差異(圖3)。

圖3 每只母溞第一胎產溞數量Fig. 3 The number of first brood per tested Daphnia magna

圖4 每只母溞暴露期產溞總數Fig. 4 Total fecundity per female Daphnia magna during exposure period

水樣對大型溞第一胎產溞數量的影響主要表現為增加大型溞產溞量，并隨著水處理工藝的進行差異縮小。因此，水樣中應該可能存在能夠刺激大型溞產溞的物質，根據文獻報道，廢水中部分污染物質如溴代阻燃劑得克隆[27]、除草劑芐嘧磺隆[28]長期暴露能顯著增加大型溞產溞次數和產溞總數，由此判斷本研究水樣中可能也存在某些能夠促進大型溞產溞的污染物，如具有雌激素效應的某些污染物，也可能是由于污染物之間的聯合效應引起的。

從整個廢水處理工藝可以看出，從進水到缺氧池出水各階段廢水均能顯著提高第一胎產溞數量，經好氧池處理后毒性顯著降低。

2.4 試驗周期內總產溞量

為檢驗受試溞在第一次產溞情況受到影響后，對暴露水樣是否產生適應性，從實驗開始到實驗結束共計14 d的時間內，每天記錄每只母溞的產溞量，實驗結束計算每個暴露濃度組產溞總數，與對照組數量相差20%以上認為具有顯著性差異。如圖4所示，在100%原水樣品測試中，1#與2#樣品暴露組母溞產溞總量顯著高于對照組；6#和8#樣品暴露組母溞產溞總量顯著低于對照組；50%稀釋樣測試中，只有1#樣品暴露組母溞產溞總量仍明顯高于對照組，具有顯著性差異；5#與7#樣品暴露組母溞產溞總量明顯低于對照組，具有顯著性差異。25%稀釋濃度下，只有3#和7#樣品暴露組母溞產溞總量顯著低于對照組水平，其余樣品均未出現顯著性差異(圖4)。

經過1#100%水樣、50%稀釋水樣及2#100%水樣暴露，大型溞產溞量顯著高于對照組，這與大型溞第一胎產溞數量整體呈上升趨勢一致，也可以說明水樣中存在能夠刺激大型溞產溞的物質。隨著處理工藝的進行，后續水樣暴露后，陸續出現大型溞產溞量低于對照組的現象，這說明能夠刺激產溞的污染物在后續的處理工藝中逐漸被去除，同時水體樣品中也可能存在能夠抑制其產溞的污染物，這部分污染物未被去除或是未完全被去除，在刺激大型溞產溞的物質不存在后，這部分抑制性污染物起到主導作用，表現出引起大型溞產溞量減少的情況。

在2.3中已經介紹過廢水中部分污染物能刺激大型溞產溞，致產溞數量上升。同時，亦有研究表明，廢水中也存在大量能抑制大型溞產溞的污染物，如孫凱峰[26]報道壬基酚能讓溞類每次繁殖總數降低；劉青等[29]表示印楝素能抑制大型溞的生殖頻率；熊勤犁等[30]報道2,2’,4,4’-四溴二苯醚(BDE47)能使大型溞總產溞數量大幅減少；邵蕾等[14]也發現重金屬鎘暴露能降低大型溞每胎產溞總數。

污水處理廠不同取樣點污水對大型溞不存在急性毒性效應，大型溞第一胎產溞的時間、產溞量以及大型溞總產溞量能夠作為對污水處理廠各工藝階段廢水進行生殖毒性評價的有效指標；在采用A2/O工藝的污水處理廠中好氧池處理工藝對生殖毒性物質去除效果最為顯著，但是污水處理廠出水潛在的生殖毒性仍然應該引起關注。