乙草胺對蛋白核小球藻的毒性效應研究

莊航，薛文，王柳富，曹清晟，王假真，張瑩瑩，魏文志,*

1. 揚州大學動物科學與技術學院，揚州 225009 2. 江蘇高郵湖生態漁業發展有限公司，揚州 225009

乙草胺(acetochlor)于1971年由美國孟山都公司開發成功，目前是世界上最重要的除草劑品種之一，也是我國使用量最大的除草劑之一。乙草胺屬于氯乙酰胺類除草劑，主要用于防除一年生禾本科雜草和部分闊葉雜草，可通過單子葉植物的胚芽鞘或雙子葉植物的下胚軸吸收，吸收后向上傳導，阻礙雜草中的蛋白質合成，而使雜草在短時間內失綠死亡[1]。按我國農藥毒性分級標準，乙草胺雖然屬低毒除草劑，但是已有調查顯示，乙草胺可對人和試驗鼠造成長期和不可逆的影響。研究表明，職業性接觸乙草胺顯著降低男性精液量、精子活力，增加精子畸形率[2]；并且與肺癌、直腸癌、胰腺癌及黑色素瘤的發生有一定關系[3]。在飼料中添加乙草胺，通過24周的飼喂，可導致小鼠肝臟和腎臟的損壞和抗氧化系統機能障礙[4]。此外，乙草胺還被證實在小鼠的P450s酶系的作用下形成具有致癌作用的中間產物二烷基醌亞胺，增加大鼠鼻癌、肝癌和胃癌的發生率[5]。

我國乙草胺制劑每年使用量大約為2～3萬t[6]，而有效利用率僅為36.1%，其余的均進入環境中[7]，水體是諸多化學物質的匯集場所，乙草胺在我國的各大水體中的檢出率達到70%以上，例如乙草胺在遼河的濃度為8.4～826.6 ng·L-1，在長江的濃度高達398.3 ng·L-1，在近岸海水中濃度可達1 054.9 ng·L-1[8]。當然，在其他國家水體中也有乙草胺的檢出，例如美國的Yazoo河和Mississippi河的中乙草胺檢出濃度為130～1 660 ng·L-1，其在排污溝中最大濃度達11 400 ng·L-1[9-10]。

由于乙草胺在水體中的廣泛存在，其對水生動物的毒性也受到較多關注。研究表明，乙草胺暴露可以引起斑馬魚胚胎的存活率、孵化率下降，致畸率上升[11]；下調稀有鮈鯽的甲狀腺激素水平，抑制其幼體發育和大腦發育[12]；延遲蝌蚪前肢出現和后肢發育，從而影響蝌蚪的變態與生長[13]；此外，乙草胺還被發現具有雌激素作用，可引起非洲爪蟾的睪丸向卵巢發育[14]。目前，關于乙草胺對浮游植物影響的研究較少，王洪斌等[15]報道了乙草胺能夠刺激塔胞藻、綠色巴夫藻的氧化還原相關酶如超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性，李薪芳等[16]報道了乙草胺能夠刺激銅綠微囊藻SOD和過氧化物酶(POD)活性。2個研究均證明了乙草胺可對浮游植物產生氧化脅迫，影響其生長性能。但是除了氧化脅迫外，乙草胺是否對浮游植物還有其他影響尚不明確，因此需要更多的研究來探索。

蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)是地球上最早出現的生命體之一，屬于綠藻門中的一種，為球形單細胞淡水藻，直徑為3～8 μm，在水體中分布極為廣泛。蛋白核小球藻富含蛋白質和葉綠素等成分，是一種高效的光合植物，并且易于在實驗室培養，是一種理想的毒理學模式生物[17]。因此，本實驗以蛋白核小球藻為模型，研究不同濃度的乙草胺對蛋白核小球藻的生長性能、葉綠素和光合作用產氧的影響，并研究了藻類光合作用相關基因光合系統基因A(psbA)、核酮糖-l,5-二磷酸羧化/加氧酶(rbcS)和1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(rbcL)在乙草胺作用下的表達情況，為乙草胺的對浮游植物的影響提供新的依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

蛋白核小球藻購自中國科學院水生生物研究所，乙草胺原藥購自西亞試劑(95%原藥)。

1.2 實驗方法

1.2.1 小球藻的培養及乙草胺暴露實驗

小球藻的培養在500 mL的錐形瓶中進行，培養前錐形瓶采用干熱消毒，在烘箱中加熱至120 ℃，時間維持到2 h。培養用水煮沸至95 ℃消毒。培養液使用BG11。每個錐形瓶中加入300 mL的培養液。接入藻種后于光照培養箱培養，蛋白核小球藻初始濃度為3 500 ind.·mL-1，培養溫度28 ℃，光照強度3 000 Lx，間歇光周期13 h∶11 h，每6 h搖動一次，以防止藻細胞貼壁或沉淀。在錐形瓶中加入乙草胺，使得乙草胺的終濃度分別為0、1、10、100、1 000和10 000 μg·L-1，每個濃度設置3個重復，并在暴露后的1、3和7 d觀察和檢測各實驗指標。

1.2.2 小球藻密度測定

用移液器從錐形瓶中取500 μL藻液，稀釋至合適濃度，后使用血小球計數板于顯微鏡下計數。每個樣品重復計數3次，取平均值計算藻密度。

1.2.3 小球藻葉綠素含量測定

每次每個樣品取25 mL藻液，使用玻璃纖維濾膜抽濾收集藻細胞，使用90%丙酮勻漿溶解定容后，以4 000 r·min-1離心3 min收集上清液定容至10 mL。使用1 cm的比色皿和分光光度計分別在664、647、630和750 nm測光密度，用90%丙酮作為空白對照。

1.2.4 小球藻光合作用產氧測定

在每個測試時間點，每個樣品分別加10 mL藻液于100 mL的碘量瓶中，之后加入培養液直到滿瓶，封上瓶口，放置到光照培養箱中，一瓶光照(培養溫度28 ℃、光照強度3 000 Lx)，另一瓶完全遮光，24 h后，測定溶解氧含量，光照的條件下，溶解氧的增加量就是凈光合作用下釋放的量，黑暗條件下，藻類僅僅進行了呼吸作用，溶解氧含量的減少量就是呼吸消耗的量。

1.2.5 基因表達分析

采集25 mL藻液，以6 000 r·min-1離心10 min，棄上清液收集藻細胞，使用Trizol一步法進行樣品總RNA提取。通過瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計檢測RNA質量和濃度，使用去基因組反轉錄試劑盒(南京諾唯贊)進行反轉錄得到cDNA，最后用實時熒光定量法檢測各基因在各個樣品中的表達，每個樣品設3個重復，以18S做內參。使用2-delta delta Ct法分析定量數據。定量引物由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成，擴增效率均為90%～110%，定量引物序列如表1所示。

1.3 數據分析

各指標均使用平均值±標準誤(mean±SE)表示。使用單因素方差分析(one-way ANOVA)分析數據的顯著性。在分析之前首先進行數據的正態性分布(Shapiro-Wilk)以及方差同質性(Levene’ s test)檢驗，不符合正態性分布或者方差同質的數據進行log轉化，然后再進行單因素方差分析。對存在顯著性差異的數據采用Tukey post-hoc test進行后續檢驗，分析使用SPSS Statistics 17.0進行。

2 結果(Results)

2.1 乙草胺對小球藻生長的影響

由圖1可知，乙草胺濃度為1、10、100和1 000 μg·L-1時，暴露時間<7 d對小球藻的生長均無明顯影響(P>0.05)，在暴露時間為7 d時，10 000 μg·L-1乙草胺處理組中，小球藻的密度與對照組相比顯著低3.17倍，10 μg·L-1乙草胺處理組中，小球藻的密度比對照組顯著升高0.63倍。

圖1 乙草胺(Ac)對小球藻生長的影響Fig. 1 Effect of acetochlor (Ac) on the growth of C. pyrenoidosa

2.2 乙草胺對小球藻葉綠素含量的影響

如圖2所示，在暴露1 d后，與對照組相比，10和100 μg·L-1乙草胺處理組中小球藻葉綠素a的含量分別顯著降低了60%和32%(P<0.05)，葉綠素b的含量分別顯著降低了0.72倍和0.41倍(P<0.05)；在暴露3 d后，10 μg·L-1乙草胺組中葉綠素b的含量顯著提高了0.46倍(P<0.05)，葉綠素a的含量與葉綠素b的含量變化相似，但是尚未達到顯著水平(P>0.05)；在暴露7 d后，10 μg·L-1乙草胺組中小球藻葉綠素a的含量顯著增加了0.87倍(P<0.05)，10 000 μg·L-1乙草胺組中葉綠素a的含量顯著降低了1.14倍(P<0.05)；小球藻葉綠素b的含量，在1和10 μg·L-1乙草胺作用下均顯著上升了0.68倍(P<0.05)，在1 000和10 000 μg·L-1乙草胺作用下分別顯著降低了0.59倍和1.21倍(P<0.05)。

表1 定量引物序列Table 1 Primer sequences for qPCR

圖2 乙草胺對小球藻葉綠素含量的影響注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；下同。Fig. 2 Effect of acetochlor on chlorophyll content of C. pyrenoidosaNote: Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05; the same below.

2.3 乙草胺對小球藻光合作用產氧量的影響

圖3為乙草胺對小球藻光合作用產氧量的影響，在10 μg·L-1乙草胺中暴露1 d后，小球藻光合作用產氧量顯著降低了76%(P<0.05)；暴露7 d后，1和10 000 μg·L-1乙草胺組中小球藻產氧量分別顯著降低了35%和42%(P<0.05)。

2.4 乙草胺對小球藻光合作用相關基因表達的影響

圖4為小球藻光合作用相關基因在乙草胺的暴露下表達的變化。暴露1 d后，在所有濃度的乙草胺處理組中，psbA基因的表達均被顯著誘導，其中以100 μg·L-1的誘導作用最為顯著，psbA基因的表達與對照組相比顯著上升了73.40倍(P<0.05)。隨著暴露時間的延長，乙草胺對psbA的誘導作用減弱，在暴露的第7天，10和100 μg·L-1處理組中的psbA基因的表達，與對照組相比，分別顯著下降至對照的16.9%和9.92%(P<0.05)(圖4(a))。rbcL的表達變化與psbA表達變化相似，乙草胺在暴露1 d后顯示出比較強烈的誘導效應，尤其是當濃度為100 μg·L-1時(升高133.01倍)(P<0.05)，而在暴露3 d后，誘導效應顯著減弱，在暴露7 d時，除了1 μg·L-1乙草胺顯著提高了rbcL表達1.35倍(P<0.05)，其余均無顯著作用(P>0.05)(圖4(b))。rbcS基因的表達在乙草胺的暴露下，變化不同于psbA和rbcL，除了在暴露3 d后，1和10 μg·L-1乙草胺對小球藻rbcS基因沒有顯著的作用(P>0.05)外，其余均表現出顯著的誘導作用，尤其是較高濃度的誘導作用更為顯著，10 000 μg·L-1乙草胺在暴露后的1、3和7 d，分別顯著誘導rbcS基因表達升高39.86倍、192.52倍和44.85倍(P<0.05)(圖4(c))。

圖3 乙草胺對小球藻光合作用產氧量的影響Fig. 3 Effect of acetochlor on the oxygen production of C. pyrenoidosa

圖4 乙草胺對小球藻光合作用相關基因表達的影響Fig. 4 Effects of acetochlor on the expression of photosynthesis-related genes in C. pyrenoidosa

3 討論(Discussion)

乙草胺的大量使用導致了其在水環境中的廣泛分布，給水域生態系統帶來一定威脅。目前,關于乙草胺對水生動物影響的研究較多，而關于其對浮游植物影響的研究相對較少。浮游植物是水生態系統中的重要組成成分，因而評估乙草胺對浮游植物的毒性效應具有重要意義。蛋白核小球藻是一種重要的微藻資源，其繁殖快，分布廣，容易在實驗室條件下培養，并且對毒物較為敏感，因而是毒理學研究的理想材料。本實驗中，筆者以蛋白核小球藻為模式生物，使用不同濃度的乙草胺作用1、3和7 d后，檢測了小球藻的生長、葉綠素含量、光合作用產氧量以及光合作用相關基因表達這幾個指標的變化，以對乙草胺對浮游植物的毒性有進一步認識。

小球藻的生長密度顯示，在暴露1和3 d后，1～10 000 μg·L-1的乙草胺對小球藻的生長均無明顯影響；至暴露的第7天，10 μg·L-1的乙草胺對小球藻的密度增長有顯著的促進作用，而10 000 μg·L-1的乙草胺對小球藻的生長有顯著抑制作用。梁衛玲等[18]以植物體內重要的過氧化物酶(POD)為指標，研究乙草胺對浮萍的毒性，結果顯示，10～230 mg·L-1的乙草胺在暴露8 d后的毒性效應顯著高于其暴露2、4和6 d后的毒性效應，并且在暴露8 d后，90 mg·L-1乙草胺對浮萍的POD活性有顯著的誘導作用，而較高濃度(190～230 mg·L-1)對浮萍的POD活性有顯著的抑制作用。這說明，首先，高濃度的乙草胺對水生生物的毒性具有一定的蓄積性，這可能與其在水環境中較長的半衰期有關，乙草胺水解半衰期通常是2 310 d (pH 7～10)[19]；其次，乙草胺與許多其他毒物類似，低濃度時可通過激活生物的應激反應，來提高生物對不同程度脅迫作用的抵抗能力，比如萘、菲以及納米氧化物對小球藻的毒性也表現出該效應[20-21]。

相對于小球藻的生長密度指標而言，葉綠素含量的變化更為敏感。在暴露的第1天葉綠素a和b的含量在100和1 000 μg·L-1處理組顯著下降，在暴露第3天，葉綠素a的含量在100 μg·L-1處理組有顯著上升趨勢，葉綠素b含量也顯著上升。值得注意的是，在暴露1和3 d后，小球藻的密度在各處理組并無顯著變化，所以這2個時間點葉綠素含量的變化體現的是小球藻藻體內部含量的變化。因此，推測暴露剛開始時，在10 μg·L-1的較低濃度組，葉綠素對乙草胺的刺激比較敏感，含量迅速下降，但是機體很快表現出較強烈的應激機制，葉綠素的含量迅速上升。在暴露7 d后，小球藻葉綠素含量變化更為顯著，但根據葉綠素變化倍數與藻密度變化倍數的關系可發現，在10和10 000 μg·L-1處理組中，藻密度的變化是葉綠素單位體積總量變化的主要原因。在暴露第7天，葉綠素b的含量在1 μg·L-1乙草胺處理組顯著上升，而且這個變化不是因為藻密度，而是其自身含量上升，所以1 μg·L-1乙草胺對藻類同樣具有毒性效應，只是相對于10 μg·L-1等較高濃度，需要累積更長時間。葉綠素含量的變化會直接影響光合作用產氧效率[22]，所以本實驗中在10 μg·L-1乙草胺處理1 d后以及10 000 μg·L-1乙草胺處理7 d后，光合作用產生氧氣量變化可能是由于葉綠素含量下降所致。葉綠素a和葉綠素b的比值對植物的光合作用影響較大[23]，在暴露3 d和7 d后，1 μg·L-1乙草胺處理組中葉綠素a和葉綠素b的含量上升幅度不同，葉綠素a和葉綠素b的比值必定發生變化，所以光合作用產氧量下降可能由于這個原因所致。

Dl蛋白是光系統Ⅱ(PSⅡ)反應中心的2個核心蛋白之一，在光合作用中介導電子傳遞(光能捕獲)作用，由pbsA基因編碼。因此，pbsA是高等植物和藻類葉綠體基因組中的一個重要光調控基因[24]。pbsA在乙草胺暴露1 d后表達顯著上調，而隨暴露時間延長上升幅度減小，至暴露第7天，pbsA在部分濃度組中下降。這說明，短時間乙草胺暴露可能對小球藻的光捕獲能力有刺激作用，即小球藻對乙草胺毒害作用的反饋調節，而長時間的乙草胺暴露會逐漸減弱小球藻的光捕獲能力。核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用中催化碳固定的關鍵酶。Rubisco不僅催化卡爾文循環中CO2的固定，同時也參與植物光呼吸代謝過程，消耗植物光合作用合成的有機物，從而影響植物的凈光合速率。常見Ⅰ型Rubisco酶由8個大亞基(RbcL)和8個小亞基(RbcS)組成。其中RbcL主要起催化作用，而RbcS主要起調節大亞基活性作用[25-26]。rbcL在乙草胺作用下表達模式與pbsA類似，rbcS基因的表達則是一直上升，但光合作用產氧量并未隨基因表達的上升而上升，說明rbcL與rbcS的變化可能同樣是小球藻對乙草胺對其光合作用損傷的反饋調節。

由此可見，乙草胺對蛋白核小球藻的毒性具有蓄積性，即較低濃度的乙草胺暴露可刺激其的生長，而較高濃度乙草胺則會抑制其生長；并且乙草胺會通過影響小球藻葉綠素的含量進而影響光合作用產氧量；光合作用相關基因pbsA、rbcL和rbcS在乙草胺暴露下變化顯著，可能是小球藻對乙草胺毒害的反饋調節作用。

致謝：感謝高郵市科技項目(NO. GY201816)對本研究的資助。