甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽對海洋橈足類日本虎斑猛水蚤的急慢性毒性效應

王晶，莊昀筠,2，陳洪舉,2，陳暢，毛雪微，劉光興,2,*

1. 中國海洋大學環境科學與工程學院，青島 266100 2. 青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋生態與環境科學功能實驗室，青島 266200

有研究表明，阿維菌素通過抑制無脊椎動物的神經傳導引起其麻痹和死亡[1-3]，以阿維菌素為基礎半合成的甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(簡稱甲維鹽，emamectin benzoate, EMB)是一種新型的殺蟲劑，由于低毒、高效等特點，被廣泛用于農業和水產養殖業。甲維鹽對于作物害蟲如鱗翅目(Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)等具有良好的殺滅作用[4-5]。在水產養殖上，甲維鹽作為魚類飼料添加劑用于去除大西洋鮭魚(Salmosalar)、大麻哈魚(Oncorhynchusketa)身上的寄生性橈足類，包括鮭瘡痂魚虱(Lepeophtheirussalmonis)、智利魚虱(Caligusrogercresseyi)等[6-7]。2002—2015年，蘇格蘭的鮭魚產量增加1倍，而甲維鹽的用量增加了5倍[8]。甲維鹽隨魚糞和飼料進入海洋環境后，沉降進入沉積物[9]。在沉積物中，其降解速率大大減緩，并隨時間推移逐步擴散進入水體[10-11]。在水/沉積物系統中，甲維鹽會長期存在，半衰期可超過120 d[10]。這很可能對其他水生生物造成毒害作用，進而影響種群動態、群落結構及食物網功能。

橈足類是海洋食物鏈中重要的次級生產者和餌料基礎，對于維持海洋生態系統的平衡與穩定具有至關重要的作用[12-13]。海洋橈足類有的營自由生活，也有的營寄生生活。甲維鹽既然可以有效殺滅寄生性橈足類，那是否也會影響到營自由生活的橈足類？目前已有的相關研究較少，Willis和Ling[14]評估了甲維鹽對4種海洋浮游橈足類的急性和亞致死毒性影響，衣曉燕[15]在個體和分子水平上研究了甲維鹽對火腿偽鏢水蚤(Pseudodiaptomuspoplesia)的毒性作用。

本研究以營自由生活的橈足類——日本虎斑猛水蚤(TigriopusjaponicusMori)為對象，研究不同濃度甲維鹽暴露對其產生的急性毒性效應(包括半數致死濃度、半數效應濃度、攝食率以及各生化指標變化)和慢性毒性效應(包括發育時間、發育率和10 d產卵量)，為評估甲維鹽對海洋橈足類的潛在影響提供數據支持和科學依據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 橈足類的采集與馴化

日本虎斑猛水蚤采自青島市魯迅公園潮間帶，由中國海洋大學海洋生命學院底棲生物實驗室提供。馴養條件為：鹽度30，溫度20 ℃，光照12 h(L)∶12 h(D)。餌料為三角褐指藻(Phaeodactylumtricomutum)(4.0×104cells·mL-1)、青島大扁藻(Platymonashelgolandicavar.tsingtaoensis)(4.0×104cells·mL-1)和酵母(2.0×104cells·mL-1)的混合。培養用海水取自青島沙子口近海，經0.45 μm微孔濾膜過濾，高溫高壓滅菌后使用。

1.2 甲維鹽溶液的配制

稱取純度為99.4%的甲維鹽(PESTANAL?Sigma-Aldrich, USA)，將其溶于二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)(國藥集團化學試劑有限公司)，配制成20 g·L-1的貯存液，于4 ℃避光保存。

1.3 急性毒性實驗

1.3.1 半數致死濃度

實驗設定不同甲維鹽濃度組(雌性1 000、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000和20 000 μg·L-1，雄性100、800、1 000、1 600、2 000、3 000、3 200、4 000、6 400和12 800 μg·L-1)，1個海水對照組和1個DMSO溶劑對照組。每組設3個平行，每個平行10只個體，置于100 mL燒杯。餌料為青島大扁藻，投喂終濃度為1×105cells·mL-1，溫度、鹽度和光照與馴化條件一致，48 h換水(50%)一次。記錄24、48、72和96 h的死亡率。以解剖針輕觸橈足類無反應且其體內腸道無蠕動活動，視為死亡。

1.3.2 半數效應濃度

挑選雌性日本虎斑猛水蚤成體，實驗濃度組設置為0.5、1、2、3.5和5 μg·L-1，其他設置同半數致死濃度實驗。觀察24 h橈足類的狀態，記錄個體效應情況。以橈足類趴在燒杯底超過10 s，僅在解剖針輕觸刺激下才活動并且活動能力較弱為產生個體效應。

1.4 攝食實驗

挑選掛卵雌性成體，暴露在不同濃度甲維鹽溶液(0.5、1、2、3.5和5 μg·L-1)中，作為實驗組。另設置1個對照組和1個溶劑對照組。每組3個平行，每個平行放置10只個體于100 mL藍色絲口瓶。投喂對數生長期的青島大扁藻，稀釋至終濃度1.0×105cells·mL-1。用鋁箔包裹瓶身，放于恒溫培養箱中，每8 h緩慢顛倒搖晃絲口瓶。培養24 h后，將藻液用魯哥氏液固定，用Sedgewick-Rafte浮游植物計數框計數。使用Frost公式計算攝食率和濾水率[16]。

1.5 生化指標

將掛卵雌性成體暴露于不同濃度甲維鹽(0.5、1、2、3.5和5 μg·L-1)24 h，測定日本虎斑猛水蚤的過氧化氫酶(catalase, CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)活性以及乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase, AChE)。另外，實驗設置1個對照組和1個溶劑對照組。每個100 mL燒杯放置100只個體，設置3組平行。恒溫培養24 h后，隨機取80只裝入1.5 mL離心管中，加入0.9%的生理鹽水，用小杵研磨至未見明顯組織塊，獲得組織勻漿液。將勻漿液在2 500 r·s-1的轉速下離心10 min，取上清液，用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定CAT活性、SOD活性、GPx活性和AChE活性，用于測定以上指標所用的組織勻漿液濃度分別為5%、1%、1%和10%。

1.6 慢性毒性實驗

在日本虎斑猛水蚤無節幼蟲孵化后24 h內，挑選活躍的個體暴露在不同濃度的甲維鹽溶液中(0.025、0.05、0.25、0.5和2.5 μg·L-1)，作為實驗組；同時設置1個對照組和溶劑對照組，每組設3個平行。連續暴露2代標記為F1、F2，將F2掛卵雌性成體放入無毒的海水中孵化，將產出的無節幼體標記為F3，在海水中“恢復”培養。每10只無節幼蟲培養在六孔培養板盛有8 mL膜濾海水的小孔中，橈足幼體轉移到50 mL燒杯。每48小時更換50%體積的培養液，餌料、溫度和鹽度等實驗條件與急性毒性實驗相同。記錄個體的存活和發育狀況、每階段發育時間。將每組成功發育個體的發育時間加權平均，作為該組在該階段的發育時間。將掛卵雌性投入至六孔培養板中，每孔1只，每個平行組取6只，培養10 d，記錄產卵次數和每批次產卵量[17]。

1.7 數據處理

回歸分析使用Origin 8.5(OriginLab, USA)，獲得96 h-LC50、24 h-EC50；單因素方差分析(One-Way ANOVA)、雙因素方差分析(Two-Way ANOVA)和LSD多重比較檢驗采用SPSS20.0(IBM, USA)，P<0.05為差異顯著；Pearson相關性分析采用SPSS20.0(IBM, USA)，P<0.05為顯著相關。

2 結果(Results)

2.1 半數致死濃度和半數效應濃度

甲維鹽對日本虎斑猛水蚤雄性和雌性的96 h半數致死濃度(96 h-LC50)分別為7 156 μg·L-1和3 637 μg·L-1(圖1)。其中，雄性在6 400 μg·L-1全部死亡；而雌性在6 000 μg·L-1死亡率僅為10%，在20 000 μg·L-1全部死亡。EMB對雌性個體的24 h半數效應濃度(24 h-EC50)為3.5 μg·L-1(圖2)。

圖1 甲維鹽對雌雄性日本虎斑猛水蚤96 h的致死劑量響應曲線注：雌性擬合曲線公式為雄性擬合曲線公式為Fig. 1 Susceptibility of female and male T. japonicus to emamectin benzoate (EMB) for 96 h exposureNote: Mortality data were fitted to a dose response curve (variable slope);.The equation for female is r2=0.999, P<0.01; the equation for male is r2=0.937, P<0.01.

圖2 甲維鹽對雌性日本虎斑猛水蚤24 h的效應劑量響應曲線注：擬合曲線公式為Fig. 2 Susceptibility of female T. japonicus to EMB for 24 h exposureNote: Effective concentration data were fitted to a dose response curve(variable slope); the equation is r2=0.807, P<0.01.

2.2 對攝食的影響

隨著甲維鹽濃度升高，日本虎斑猛水蚤攝食率和濾水率均呈現降低的趨勢(圖3)。0.5 μg·L-1濃度組的攝食率和濾水率與對照組相比無顯著差異(P>0.05)。當甲維鹽濃度≥1 μg·L-1，實驗組與對照組差異顯著(P<0.01)，均值明顯降低。在5 μg·L-1組攝食率和濾水率達到最低，均值低至2 412 cells·(ind·h)-1和0.011 mL·(ind·h)-1，僅為對照組的29%和28%。

圖3 甲維鹽對日本虎斑猛水蚤攝食率和濾水率的影響注：a、b、c表示不同暴露濃度下的組間差異性，P<0.05；*P<0.05、**P<0.01表示各實驗組與對照組的差異性；control代表對照組，solvent代表溶劑對照組；下同。Fig. 3 The effect of EMB on the grazing rate and filtering rate of T. japonicus Note: Different letters indicate a significant difference among EMB treatments at P<0.05; *P<0.05, **P <0.01 denote significant difference from the control; the same below.

2.3 對生化指標的影響

暴露在不同濃度的甲維鹽下，日本虎斑猛水蚤體內的抗氧化酶SOD和GPx活性均出現顯著的變化(P<0.05) (圖4)。在一定濃度范圍內，SOD和GPx活性隨甲維鹽濃度升高而升高，在超過一定濃度后，趨于平穩。其中，SOD活性在1.0～3.5 μg·L-1出現增長趨勢，在3.5 μg·L-1最高，達到48.7 U·mg-1prot；GPx活性在0.5～1.0 μg·L-1上升明顯，在1 μg·L-1最高，達到118.8 U·mg-1prot。兩者分別在3.5～5.0 μg·L-1和1.0～5.0 μg·L-1趨于平緩。二者變化趨勢顯著正相關(r=0.746、P<0.05)。實驗濃度范圍內，CAT活性較對照組無顯著變化(P>0.05)。

AChE與SOD、GPx具有相似的變化趨勢，酶活性隨著甲維鹽濃度的升高而上升。在甲維鹽濃度達到3.5 μg·L-1時，實驗組AChE活性與對照組相比顯著升高，達到2.4 U·mg-1prot，為對照組的1.4倍。且AChE與SOD、GPx活性的變化趨勢呈顯著正相關(AChE與SOD，r=0.733、P<0.05；AChE與GPx，r=0.541、P<0.05)。

2.4 對生殖發育的影響

F1和F2日本虎斑猛水蚤無節幼蟲變態至橈足幼體CΙ期所需時間均為5～8 d，橈足幼體發育為成體的時間為6～10 d(圖5)。在無節幼蟲發育時間上，F1中0.05 μg·L-1和0.25 μg·L-1濃度組與對照組差異顯著(P<0.05)，F2未見實驗組與對照組相比有顯著性差異(P>0.05)；在橈足幼體發育時間上，F1中0.5 μg·L-1濃度組相比對照組顯著下降(P<0.05)，F2中0.025 μg·L-1濃度組與對照組相比顯著降低(P<0.05)。但日本虎斑猛水蚤的發育時間并未呈現隨甲維鹽濃度變化而規律性變化的趨勢。無節幼蟲的發育率隨甲維鹽濃度變化不大，但橈足幼體發育率明顯低于無節幼蟲，且有隨甲維鹽濃度升高而降低的趨勢(圖6)。未發育成功的個體表現出發育停滯的現象。在總發育率上，當甲維鹽濃度≥0.05 μg·L-1時，日本虎斑猛水蚤發育率不斷降低；當濃度達到0.5 μg·L-1時，發育率相較對照組顯著降低(P<0.05)；濃度達到2.5 μg·L-1，幼體全部死亡。F3為恢復世代，在發育時間上，無節幼蟲變態至橈足幼體CΙ期僅有0.25 μg·L-1濃度組較對照組顯著升高(P<0.05)；橈足幼體到成體時期各實驗組較對照組未顯著變化(P>0.05)。F3發育率的變化趨勢與F1、F2相同。

圖4 甲維鹽對日本虎斑猛水蚤生化指標的影響Fig. 4 The effect of EMB on the activities of the antioxidant enzymes of T. japonicusNote: SOD is superoxide dismutase; GPx is glutathione peroxidase; CAT is catalase; AchE is acetylcholinesterase.

圖5 甲維鹽對日本虎斑猛水蚤發育時間的影響注：F1、F2為暴露世代，F3為恢復世代。Fig. 5 Effect of EMB on the developmental time of T. japonicusNote: F1 and F2 were exposed to EMB, and F3 was recovered in sea water.

圖6 甲維鹽對日本虎斑猛水蚤發育率的影響注：***P<0.001表示各實驗組與對照組的差異性。Fig. 6 Effect of EMB on the successful development rate of T. japonicusNote: ***P<0.001 denotes significant difference from the control.

圖7 甲維鹽對雌性日本虎斑猛水蚤10 d孵化量的影響Fig. 7 Effect of EMB on the 10 day fecundity of female T. japonicus

3個世代雌性個體的10 d產卵次數均為3次，對照組和溶劑對照組產卵量的平均值在69～77個(圖7)。當甲維鹽濃度達到0.5 μg·L-1時，產卵量平均值在58～64個。F1、F2和恢復世代F3均可見甲維鹽濃度達到0.5 μg·L-1時，總產卵量與對照組相比有顯著性差異(P<0.05)，明顯降低。

對F1、F2和F3進行雙因素方差分析(表1)可得：在無節幼蟲、橈足幼體的發育時間和橈足幼體的發育率上，甲維鹽濃度和世代存在交互關系。無節幼蟲、橈足幼體的發育時間上，3代之間均有顯著性差異(P<0.01)；而橈足幼體的發育率上，F2、F3與F1有顯著性差異(P<0.05)，F2與F3之間沒有顯著性差異(P>0.05)。在無節幼蟲的發育率、總發育率和10 d產卵量上，甲維鹽濃度和世代不存在交互關系。其中，無節幼蟲的發育率和總發育率對于世代的主效應差異不顯著(P>0.05)；10 d產卵量對于世代的主效應差異顯著(P<0.05)，且F2、F3與F1有顯著差異(P<0.01)，F2與F3之間沒有顯著性差異(P>0.05)。

表1 日本虎斑猛水蚤的生殖發育受甲維鹽濃度和世代影響的顯著性檢驗Table 1 Significance test displaying the effects of EMB treatment and generation on reproductive development of T. japonicus

注：t1、t2表示橈足類無節幼蟲、橈足幼體的發育時間，r1、r2和r3表示橈足類無節幼蟲、橈足幼體和整個發育過程的發育率，f表示10 d產卵量。

Note: t1, t2 represent the development time of nauplii stage and copepodite stage; r1, r2 and r3 represent the development rate from nauplii to copepodite, from copepodite to adult, and of the complete development process respectively; f represents the 10 day fecundity.

綜合各個指標，F3并未表現出恢復跡象。

3 討論(Discussion)

3.1 急性毒性影響

猛水蚤相比浮游橈足類通常具有較強的抵御環境變化的能力。例如，猛水蚤對硫化鋅和束毛藻(Trichodesmiumspp.)毒素的耐受能力顯著高于浮游橈足類[18-19]。本研究中甲維鹽對日本虎斑猛水蚤雌性個體的96 h-LC50為7 156 μg·L-1，雄性為3 637 μg·L-1。衣曉燕[15]的研究表明，甲維鹽對浮游橈足類火腿偽鏢水蚤的96 h-LC50為22.9 μg·L-1，遠遠低于日本虎斑猛水蚤。猛水蚤對甲維鹽的耐受能力顯著高于浮游種類。甲維鹽對寄生性橈足類Lepeophtheirusmugiloidis和雌性智利魚虱的24 h-EC50比日本虎斑猛水蚤的3.5 μg·L-1高1～2個數量級，分別為34.2 μg·L-1和169.0 μg·L-1[7,20]。猛水蚤對甲維鹽的敏感度比寄生性橈足類高。

甲殼動物對污染物的敏感度通常存在性別差異。如在魚藤酮(rotenone)、多氯聯苯(polychlorinated biphenyl Aroclor 1254)和多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons)暴露條件下，雄性猛水蚤比雌性敏感[21-23]。本研究也顯示，雌性與雄性對甲維鹽的耐受性存在差別，并與上述研究中猛水蚤不同性別對于外源污染物的敏感度類似。另外，也有研究表明，甲維鹽暴露下，鮭瘡痂魚虱雌性比雄性更加敏感[24-25]，不同物種雌雄個體對于甲維鹽的敏感性可能存在差異。

3.2 甲維鹽對橈足類攝食的影響

在本研究中，隨著甲維鹽濃度的增加，日本虎斑猛水蚤的攝食率和濾水率降低。暴露于3.5 μg·L-1甲維鹽24 h后，日本虎斑猛水蚤出現部分個體趴底，運動能力明顯下降的現象，而5 μg·L-1時，所有個體均趴底，無自主活動能力，這會嚴重影響到其攝食和濾水的效率。Willis和Ling[14]的研究表明，甲維鹽暴露條件下，4種浮游橈足類也出現運動能力顯著下降，無法攝食。甲維鹽可能通過麻痹神經的作用[1-3]，使橈足類無法攝食，抑制能量的攝入，影響正常的生命活動，對機體造成危害。

3.3 甲維鹽對生化指標的影響

SOD、CAT和GPx是抗氧化防御系統中重要的抗氧化酶，對清除機體內活性氧，保護機體免受氧化損傷發揮著重要作用[26-27]。一般認為，受輕度毒物影響，SOD活性升高；而重度脅迫條件下，SOD活性下降，出現氧化損傷[28-29]。日本虎斑猛水蚤在Hg的脅迫下，SOD和GPx活性會隨Hg濃度的升高先上升后下降[30]；在三氯生(triclosan)的作用下，SOD活性隨濃度的升高而升高[31]。本研究中，隨著甲維鹽濃度的升高，日本虎斑猛水蚤的SOD和GPx活性上升，并未出現下降。甲維鹽激發了日本虎斑猛水蚤體內抗氧化防御系統SOD和GPx的應激反應，出現“毒物興奮效應”[28]，但甲維鹽的最高濃度的脅迫也可能未超過日本虎斑猛水蚤防御機制的能力。不同的是，暴露在所有濃度的甲維鹽中，日本虎斑猛水蚤CAT活性均未出現顯著變化，可能的原因是本研究設置的濃度和測定時間沒有達到CAT的誘導閾值，或者超過CAT的反應時間。日本虎斑猛水蚤暴露于最高濃度5 μg·L-124 h后，雖然行動能力下降，但抗氧化還原體系僅部分抗氧化酶被激發解毒，并未超過自身的防御能力。

AChE存在于絕大多數水生生物中，是連接感受器與神經肌肉的重要神經傳遞物質，通過催化乙酰膽堿，使其水解為乙酸和膽堿，維持神經沖動的正常進行[32-34]。AChE活性無論受到抑制還是誘導都會給生物體帶來危害。有研究認為甲維鹽會影響AChE的活性。在甲維鹽的作用下，小鼠(Rattusnorvegicus)的AChE被顯著抑制，活性降低[35]。在本研究中，暴露于甲維鹽24 h對AChE活性的影響顯著趨于誘導，可能導致橈足類神經沖動傳遞出現障礙，造成橈足類反應能力下降，行動遲緩，甚至麻痹死亡。

3.4 甲維鹽對橈足類生殖發育的影響

日本虎斑猛水蚤的發育時間隨甲維鹽濃度變化無明顯的變化規律，但發育率隨甲維鹽濃度的升高而降低，在0.5 μg·L-1甲維鹽濃度下，F1、F2到成體的發育率都低于80%，F1僅為49%。衣曉燕[15]的研究也表明，隨著甲維鹽濃度的升高，火腿偽鏢水蚤幼體的存活率和發育率呈下降趨勢。甲維鹽對日本虎斑猛水蚤產卵次數的影響并不明顯；但在10 d產卵量上，暴露于0.5 μg·L-1的實驗組與對照組相比在F1、F2均出現顯著降低(P<0.05)。有研究表明，甲維鹽對智利魚虱的孵化率也有顯著影響[36]。甲維鹽可能使雌性橈足類為抵御不良狀態而降低產卵量，從而抑制橈足類的繁殖能力，并影響橈足類幼體的生長發育，導致種群數量減少，進而影響群落結構和海洋生態系統功能。

甲維鹽對橈足類的生存和繁殖力的毒害影響都是不可恢復的[14]。本研究表明，經兩代甲維鹽暴露后，在海水恢復處理下日本虎斑猛水蚤F3的發育率和孵化能力與F1、F2相比，并未出現恢復跡象。甲維鹽對于橈足類的影響可由親代傳遞給子代，可能不可恢復。在發育率和產卵量上，F2、F3與F1之間有顯著性差異，而F2與F3差異不大，分析原因可能是慢性毒性世代F2相較F1出現一定的抗性，F3延續了這種抗性，尚未恢復正常的繁殖狀態。

綜上所述，日本虎斑猛水蚤對甲維鹽的敏感度比寄生性橈足類高，耐受能力比浮游橈足類高；雄性的耐受能力比雌性低；暴露條件下，日本虎斑猛水蚤的運動能力、攝食率和濾水率受到嚴重影響，而SOD和GPx活性被激發，AChE被顯著誘導，CAT活性無顯著變化；并且甲維鹽會降低日本虎斑猛水蚤的發育率和產卵能力。甲維鹽可能會減小橈足類的種群規模，影響群落結構和食物網功能。如何合理使用甲維鹽等農藥，既滿足農業生產和水產養殖的需要，又盡可能減少對海洋生態環境的影響有待進一步探討。