苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對皺紋盤鮑(Haliotis discus hannai)早期發(fā)育的毒性研究

多環(huán)芳烴(PAHs)作為化工溶劑廣泛應(yīng)用于化工行業(yè)中，是石油及其副產(chǎn)品的重要組成成分，近年來，由于工業(yè)活動日益頻繁，導(dǎo)致水生生態(tài)系統(tǒng)中多環(huán)芳烴的含量日益增加[1]。隨著海洋石油運輸、石油開發(fā)、海洋溢油和沿海石油化工業(yè)的快速發(fā)展，多環(huán)芳烴易進(jìn)入水體，進(jìn)而破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)的平衡，威脅水生生物和人類的健康[2]。多環(huán)芳烴致畸、致癌和致突變的特性顯著[3]，生物毒性極強，由此引發(fā)的近岸海洋生態(tài)環(huán)境危害引起社會和學(xué)者廣泛關(guān)注。各國都將其列為水環(huán)境優(yōu)先控制的污染物之一[4]，我國的《室內(nèi)空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T 18883—2002)、《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》(GB 8978—1996)、《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB 3838—2002)都將其列為環(huán)境調(diào)查項目和污染參數(shù)。目前，國內(nèi)外關(guān)于多環(huán)芳烴的研究主要集中在大氣、土壤、淡水和沉積物中，對于海洋中多環(huán)芳烴的研究主要集中在水生動植物多環(huán)芳烴的檢測等方面，因此，在多環(huán)芳烴對水生生物生態(tài)毒性方面開展更深層次的探討，對研究多環(huán)芳烴對我國海洋環(huán)境危害方面具有重大意義[5-6]。

皺紋盤鮑(Haliotisdiscushannai)，屬于原始腹足目，腹足綱。在我國鮑類養(yǎng)殖的總產(chǎn)量中占有主導(dǎo)地位，是我國北方海域一種重要的海洋養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)種類。作為海洋中的珍品，皺紋盤鮑肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，有多種醫(yī)用功效和抗癌作用，食用和藥用價值極高[7]。目前，關(guān)于皺紋盤鮑的研究集中在有害藻華對鮑的急性毒性影響[8]，溫度變化對鮑的生理活動影響機制[9]，不同光照對皺紋盤鮑生長和存活的影響[10]，分析鮑自身的免疫相關(guān)基因?qū)︴U死亡的影響，研究相關(guān)病害的治療和防護(hù)關(guān)系等方面[11]。本實驗以皺紋盤鮑為研究對象，采用半靜水式實驗方式，研究不同濃度苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽作用下皺紋盤鮑的卵子受精率、胚胎發(fā)育時間和幼體死亡率的差異。為探究皺紋盤鮑對多環(huán)芳烴污染的耐受能力，保護(hù)海洋生態(tài)環(huán)境和海洋養(yǎng)殖業(yè)以及科學(xué)制定多環(huán)芳烴的水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，評估多環(huán)芳烴對海洋環(huán)境和水生生物質(zhì)量安全的風(fēng)險提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

實驗皺紋盤鮑購自大連海寶漁業(yè)有限公司，挑選健康的個體，殼長8～9 cm，實驗海水為大連黑石礁海域的砂濾海水，每24 h定時換水，投喂鮑魚體重30%的海帶，24 h持續(xù)微充氣。實驗過程中水體控制在水溫(20±1) ℃，鹽度30～31，pH 8.1～8.2，溶解氧保持在6 mg·L-1以上。從中挑選性腺飽滿的個體，進(jìn)行陰干、紫外線照射、海水刺激，獲得精子、卵子用于后續(xù)實驗。

苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽，純度大于96%，購自Sigma公司；丙酮(純度99.5%)、過氧化氫(體積分?jǐn)?shù)為30%)和三羥甲基氨基甲烷購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽用丙酮作助溶劑配制成高濃度的儲備液，實驗時根據(jù)需要，向?qū)嶒灪Ｋ刑砑硬煌w積的儲備液稀釋至實驗所需的不同多環(huán)芳烴濃度。

1.2 實驗方法

1.2.1 2種多環(huán)芳烴對鮑魚受精率的影響

受精率毒性實驗在1 L玻璃燒杯中進(jìn)行，根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，分別確定苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽的實驗濃度范圍，設(shè)置為0.1、0.5、1、5、10和20 μg·L-1處理組，并設(shè)置空白對照組和丙酮助溶劑對照組，其中丙酮濃度為1‰，每組設(shè)置3個平行樣，實驗條件與培養(yǎng)條件相同。卵子的密度約為50個·mL-1，精子密度約為50萬個·mL-1，每個實驗組的溶液共加入500 mL。持續(xù)攪拌均勻，鏡檢空白對照組的卵子受精率大于90%時，取樣觀察并計算各處理組的卵子的受精率。

1.2.2 2種多環(huán)芳烴對鮑魚胚胎幼體的影響

實驗過程中水體控制在與培養(yǎng)條件相同的條件下，在胚胎生長發(fā)育階段進(jìn)行避光培養(yǎng)，不曝氣，不投餌。經(jīng)預(yù)實驗，分別確定苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽的實驗濃度范圍，按等對數(shù)間距法設(shè)置4個質(zhì)量濃度梯度組，并設(shè)一個空白對照組和一個助溶劑對照組(丙酮)，每個處理組設(shè)立3個平行實驗。苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽濃度設(shè)置為0.1、0.5、1和5 μg·L-1，持續(xù)處理5 d，空白對照組胚胎發(fā)育至匍匐幼體期，取樣進(jìn)行鏡檢，記錄各處理組皺紋盤鮑從擔(dān)輪幼體期到匍匐幼體期的各個發(fā)育時期胚胎所需時間的差異。

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，遵循相關(guān)的養(yǎng)殖以及毒性試驗方法標(biāo)準(zhǔn)，苯并[a]芘實驗組濃度設(shè)置為1、5、10和20 μg·L-1；9,10-二甲基蒽實驗組濃度設(shè)置為1、5、10和50 μg·L-1。各處理組持續(xù)處理12 d，3～12 d中每天下午3點對各處理組進(jìn)行檢查，記錄各處理組中鮑魚幼體的死亡數(shù)，計算幼體死亡率，及時清除死亡個體(死亡判定標(biāo)準(zhǔn)為在顯微鏡下觀察心跳停止為死亡[12])。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，求出死亡率和2種多環(huán)芳烴濃度對數(shù)的回歸方程，分別計算每組的LC10。

實驗結(jié)果采用SPSS 19.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析，分析處理組和對照組之間的差異，在數(shù)據(jù)處理中，采用T-test檢驗，P<0.05、P<0.01時表示差異顯著，以“*”、“**”表示。

2 結(jié)果(results)

2.1 多環(huán)芳烴對種鮑受精的影響

苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對皺紋盤鮑卵子受精率的影響結(jié)果如圖1和圖2所示，濃度為0.5、1、5、10和20 μg·L-1的苯并[a]芘處理組中受精率顯著下降(P<0.05)，其他處理組與空白對照組相比無顯著差異變化；濃度為0.1、0.5、1、5、10和20 μg·L-1的9,10-二甲基蒽處理組與空白對照組相比受精率顯著下降(P<0.05)。這表明，苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽高濃度處理組對皺紋盤鮑卵子的受精有顯著抑制作用，濃度越高抑制作用越顯著，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。丙酮對照組與空白對照組的受精率無顯著變化(P=0.225>0.05)，表明丙酮助溶劑對照組可代替空白對照組。

圖1 不同濃度苯并[a]芘作用下皺紋盤鮑的受精率注： * P <0.05、** P <0.01表示與對照組相比，差異顯著；下同。Fig. 1 Fertilization rate of abalone under the treatment of benzo [a] pyrene at different concentrationsNote: * P <0.05, ** P <0.01 mean significant difference compared with the control; the same below.

圖2 不同濃度9,10-二甲基蒽作用下皺紋盤鮑的受精率Fig. 2 Fertilization rate of abalone under the treatment of 9,10-dimethylanthracene at different concentrations

2.2 多環(huán)芳烴對皺紋盤鮑胚胎發(fā)育的影響

多環(huán)芳烴對皺紋盤鮑胚胎的毒性作用主要表現(xiàn)為，胚胎發(fā)育時間延遲，胚胎的生長受到抑制作用。如圖3和圖4所示，經(jīng)0.1、0.5、1和5 μg·L-1濃度的苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽處理后皺紋盤鮑的胚胎發(fā)育時間延長。對比于空白對照組，0.1、0.5、1和5 μg·L-1的苯并[a]芘和0.5、1和5 μg·L-1的9,10-二甲基蒽組的皺紋盤鮑胚胎發(fā)育時間顯著增加(P<0.05)。并且隨著處理濃度的升高，皺紋盤鮑胚胎發(fā)育時間延長，呈明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

圖3 苯并[a]芘作用下皺紋盤鮑胚胎發(fā)育時間Fig. 3 Development time of abalone embryos under the treatment of benzo [a] pyrene

圖4 9,10-二甲基蒽作用下皺紋盤鮑胚胎的發(fā)育時間Fig. 4 Development time of abalone embryos under the treatment of 9,10-dimethylanthracene

2.3 2種多環(huán)芳烴對皺紋盤鮑幼體的慢性毒性

由圖5和圖6可知，不同濃度的苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對皺紋盤鮑作用3～12 d后的死亡率。隨著苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽處理濃度的升高，皺紋盤鮑幼體死亡率升高，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。10、20 μg·L-1的苯并[a]芘處理組與對照組相比，死亡率在6 d之后達(dá)到最高(此時死亡率接近100%)，苯并[a]芘5 μg·L-1濃度組與對照組相比，死亡率在8 d之后達(dá)到最高(此時死亡率接近100%)。9,10-二甲基蒽各濃度組的死亡率明顯低于苯并[a]芘各濃度組。可推測苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對皺紋盤鮑幼體的毒性影響存在差異，實驗進(jìn)行6 d后，苯并[a]芘的高濃度處理組大多數(shù)鮑魚幼體全部死亡，說明苯并[a]芘對皺紋盤鮑的毒性作用高于9,10-二甲基蒽，長時間作用下對皺紋盤鮑的影響更大。

丙酮對照組和空白對照組的T-test檢驗參數(shù)P=0.3>0.05，可知丙酮對照組和空白對照組死亡率沒有顯著差異。與空白對照做T-test分析，1、5、10和20 μg·L-1的苯并[a]芘和1、5、10和50 μg·L-1的9,10-二甲基蒽處理組均表現(xiàn)為P<0.05，可知各組與空白對照組均有顯著差異。

圖5 不同濃度苯并[a]芘作用下皺紋盤鮑的死亡率Fig. 5 Mortality of abalone under the treatment of different concentrations of benzo [a] pyrene

圖6 不同濃度9,10-二甲基蒽作用下皺紋盤鮑的死亡率Fig. 6 Mortality of abalone under the treatment of different concentrations of 9,10-dimethylanthracene

2.4 2種多環(huán)芳烴對皺紋盤鮑幼體的LC10值

不同劑量的苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對皺紋盤鮑幼體LC10結(jié)果詳見表1。苯并[a]芘對皺紋盤鮑幼體在1、5、10和20 μg·L-1時的LC10分別為11.6、8.18、7.67和7.66 mg·L-1；9,10-二甲基蒽對皺紋盤鮑幼體在1、5、10和50 μg·L-1時的LC10分別為14.91、14.11、12.82和9.64 mg·L-1。苯并[a]芘毒性大于9,10-二甲基蒽。

3 討論(Discussion)

海洋環(huán)境中多環(huán)芳烴有機污染物主要來源于海洋溢油事故和沿海石油化工業(yè)的廢水排放，對海洋生物生存和自然資源造成了嚴(yán)重破壞，已被列為我國環(huán)境優(yōu)先控制污染物名單[13-14]。根據(jù)原國家環(huán)保局1986制訂的《生物技術(shù)檢測規(guī)范(水環(huán)境部分)》標(biāo)準(zhǔn)(劇毒：LC50≤0.1 mg·L-1；高毒：0.1 mg·L-1﹤LC50≤1.0 mg·L-1；中毒：1.0 mg·L-1﹤LC50≤10.0 mg·L-1；低毒：LC50>10.0 mg·L-1)，苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽均具有致毒性，苯并[a]芘毒性較大。本實驗研究表明，各處理組的皺紋盤鮑隨苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽處理組濃度的增加和暴露時間的延長，卵子的受精率顯著降低，胚胎發(fā)育時間和幼體死亡率顯著增加，與處理濃度之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，多環(huán)芳烴濃度越高，作用時間越長，對皺紋盤鮑的早期發(fā)育影響越大。在對于多環(huán)芳烴對條紋鋸鮨(Centropristisstriata)胚胎發(fā)育及早期仔魚的毒性研究中發(fā)現(xiàn)，隨著多環(huán)芳烴濃度的增加，受精卵的孵化率降低，畸形指數(shù)和仔魚死亡率增加，表現(xiàn)出的劑量-效應(yīng)關(guān)系，這與本研究的結(jié)果相一致[15]。通常對照組死亡率不應(yīng)該超過10%，但在本實驗中對照組幼體死亡率偏高，推測可能是因為皺紋盤鮑幼體對環(huán)境的適應(yīng)能力較差，也有可能是因為在培養(yǎng)過程中，皺紋盤鮑幼體對于海水中營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生相互競爭，亦或由于天氣原因或環(huán)境溫度過高等造成皺紋盤鮑死亡[16-17]。

我國有關(guān)多環(huán)芳烴對海洋鮑類的生殖毒性作用的研究表明，胚胎和幼體是海洋生物對環(huán)境污染物最為敏感的時期，關(guān)于胚胎和幼體的研究將更直觀地反映海洋受污染的現(xiàn)狀[18]，因此，本實驗選擇皺紋盤鮑的早期發(fā)育階段。前人研究發(fā)現(xiàn)，苯并[a]芘、菲和蒽對魚類胚胎不同發(fā)育階段的生理學(xué)和形態(tài)學(xué)的損傷作用不同[19]；選取苯并[a]芘對雙齒圍沙蠶(Pernereisaibuhitensis)的3剛節(jié)疣足幼體進(jìn)行急性毒性實驗，發(fā)現(xiàn)苯并[a]芘會引起蟲體的畸形，影響沙蠶幼體的發(fā)育[20]；苯使太平洋鯡魚(Clupeaharenguspallasi)胚胎和幼蟲胚胎組織生長減緩，胚胎耗氧量增加，影響后期代謝作用[21]。高濃度的二甲苯導(dǎo)致斑馬魚(Brachydaniorerio)胚胎孵化率降低，胚胎死亡率升高，發(fā)育畸形，幼魚的運動速度減慢[22]。在本實驗濃度范圍內(nèi)，苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對皺紋盤鮑幼體有毒性損傷作用，幼體甚至發(fā)生死亡。

表1 苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽對鮑魚幼體發(fā)育的回歸方程和LC10濃度Table 1 Regression equation and 10% lethal concentration of benzo [a] pyrene and 9,10-dimethylanthracene on the development of abalone larvae

注：r為相關(guān)系數(shù)；Y為死亡率；X為多環(huán)芳烴濃度對數(shù)。

Note:ris the correlation coefficient;Yis the mortality rate;Xis the logarithm of PAHs concentration.

本實驗皺紋盤鮑胚胎和幼體在暴露于苯并[a]芘和9,10-二甲基蒽后，隨暴露時間的延長和暴露濃度的升高受精率顯著降低，胚胎發(fā)育時間和幼體死亡率顯著增加，存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系。關(guān)于PAHs對皺紋盤鮑胚胎和幼體產(chǎn)生毒性作用的機理是否與魚類胚胎或者其他海洋無脊椎動物的致毒機理一致，有必要進(jìn)一步深入研究。