汞脅迫對齒肋赤蘚生物結皮細胞超微結構的影響

劉衛國，霍舉頌，黃廷溫，瑪麗亞·努爾蘭，張雨

1. 新疆大學資源與環境科學學院，烏魯木齊 830046 2. 綠洲生態教育部重點實驗室，烏魯木齊 830046 3. 南京農業大學資源與環境科學學院，南京 210095

重金屬污染是當前危害嚴重及影響范圍最廣的環境問題之一。我國重金屬污染的耕地面積近2 000萬hm2，約占總耕地面積的20%[1]。土壤中的重金屬會對植物葉肉細胞超微結構產生毒害效應，抑制細胞核分裂，導致細胞膜的滲透機制紊亂失調，致細胞膜破損和抗氧化酶系統損傷等[2-6]。而植物在含有重金屬的土壤環境中生長，可以進化出抵御金屬離子毒害能力和耐脅迫的生態型特征[7-10]。目前的研究多采用模擬控制的脅迫條件，揭示重金屬對維管束植物的脅迫[1,11-13]，而對非維管束植物(苔蘚生物結皮)的脅迫研究報道較少。僅開展了干旱和鹽脅迫對齒肋赤蘚(Syntrichiacaninervis)細胞器超微結構影響的研究[14-15]，而重金屬脅迫對苔蘚生物結皮的研究未見報道。金屬汞通過煤炭燃燒、工業生產以及農藥噴灑等過程擴散，常轉化為可被生物吸收的脂溶性甲基汞毒性物質[16]，汞毒害效應廣泛存在于生態系統中[17-18]。汞對不同植物的脅迫，從生理、基因和細胞結構等方面進行了研究，目前有關汞對齒肋赤蘚葉片細胞超微結構的影響分析尚需深入研究。

生物土壤結皮是細菌、真菌、藻類、地衣和苔蘚等與土壤砂礫粘結的復合體，可有效改善土壤的物理、化學和生物學特性的一類復合生物體[19-20]。齒肋赤蘚結皮是非維管束植物，在新疆古爾班通古特沙漠南緣廣泛分布，已受到工業產生的重金屬污染，威脅到齒肋赤蘚等生物結皮的生存，使脆弱的生態環境面臨更嚴峻的挑戰。鑒于重金屬對維管束植物的脅迫傷害效應，假設汞會對齒勒赤蘚生物結皮造成影響，但其細胞生物學效應如何表達，與維管束植物的細胞響應機制是否一致，這需要利用試驗進行驗證。室內模擬不同汞濃度，利用掃描電子顯微鏡技術，觀察齒肋赤蘚葉肉細胞的超微結構變化，揭示齒肋赤蘚生物結皮葉片在細胞學上的抗性規律，為干旱區非維管植物適應重金屬環境補充理論基礎，也為抗性物種的培養提供一定的借鑒，為荒漠生態系統的固沙及生物多樣性保護提供參考意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

古爾班通古特沙漠南緣(44°11’N～46°20’N, 84°31’E～90°00’E)，年均溫6～10 ℃，極端高溫高于40 ℃，≥10 ℃年積溫可達3 000～3 500 ℃，年蒸發量超過2 000 mm，但是年平均降水量不超過150 mm，降水主要集中在早春到初夏時節，其中4—7月的降水量占全年的47.6%。南緣地表發育有良好的生物結皮，主要分布有沼地微鞘藻(Microcoleuspaludosus)、具鞘微鞘藻(Microcoleusvaginatus)和鞘絲異球藻(Xenococcuslyngbyge)等藻類結皮，還有膠衣屬(Collematenex)、紅鱗網衣(Psoradecipiens)和麗黃地衣(Xanthoriaelegans)等地衣結皮，以及以齒脅赤蘚(Syntrichiacanivervis)為主的苔蘚結皮。當地植物群落以小半喬木梭梭(Haloxylonammolondren)、白梭梭(Haloxylonpersicum)和沙拐棗(Calligonummongolicum)為優勢建群種，尖喙牻牛兒苗(Erodiumoxyrrhynchum)、囊果苔草(Carexphysodes)和角果黎(Ceratocarpusarenarius)等草本植物大量分布[14,19]。由于毗鄰工業園及城鎮，農藥施用和洗滌等活動致含汞污染物釋放，重金屬潛在污染的土壤面積、生物種類及數量呈增加趨勢，使脆弱的生態環境面臨更嚴峻的挑戰。

2016年3月底于樣地內選取未受干擾、生長一致且良好的齒肋赤蘚生物結皮為對象。取回置于培養箱，在溫度為(20 ± 0.5) ℃下培養以備實驗。挑選高約0.6～0.8 cm的單個植株，每100株為一個樣本置于培養皿中，依據當地齒肋赤蘚生物結皮的生長特性及預實驗結果，設定出本實驗的脅迫濃度為0、10、20、30、40、50和60 mmol·L-1，每組處理3個重復，培養至7 d。每次將樣本移入已消毒的培養皿，再進行汞溶液處理。觀察樣本的長勢及變化，從每個樣本中隨機選取3株個體用于電鏡樣品的制備。

1.2 樣品制備與觀察

切去齒肋赤蘚生物結皮的底部，保留頂部0.4 cm用于電鏡樣品制備。將樣品投入中4%的戊二醛固定液，置于4 ℃冰箱中保存3～4 d。隨后用pH 7.4的磷酸緩沖液(PBS)進行沖洗，每隔一定時間用PBS多次沖洗，總時間為2 h。之后用1%的鋨酸溶液固定1.5 h，用PBS多次沖洗0.5 h后，再用濃度梯度為30%、50%、60%、70%、80%、90%、95%和100%的乙醇逐級脫水處理，每個梯度脫水處理不低于20 min。脫水處理后，依次用丙酮/乙醇(體積比為1∶1)、丙酮/乙醇(體積比為4∶1)和純丙酮浸泡30 min。用體積比為1∶1的丙酮/環氧樹脂固定1 h后，再用體積比為1∶4的丙酮/環氧樹脂固定3 h，最后用純環氧樹脂固定，室內環境下保存過夜。將樣品進行包埋處理，在烘箱中逐級升溫至最高溫度60 ℃，使環氧樹脂凝固。使用LKB-8800型超薄切片機切片(瑞典LKB)，用醋酸鈾-檸檬酸鉛進行多重染色，而后利用JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本電子JEOL)對樣品掃描。

2 結果(Results)

2.1 對齒肋赤蘚生物結皮活性特征影響

齒肋赤蘚生物結皮經0、10、20、30、40、50和60 mmol·L-1汞溶液處理7 d。由重金屬汞脅迫下齒肋赤蘚生物結皮存活率可知(圖1)，隨著濃度增加，齒肋赤蘚由綠色或黃綠色變為黑褐色的死亡態。汞濃度0～20、30、40～50和60 mmol·L-1間存在顯著差異(P<0.01)。汞溶液對齒肋赤蘚活性產生抑制效應的濃度為20 mmol·L-1。前4天內，不同濃度處理間齒肋赤蘚活性沒有差異，從第4或第5天開始出現齒肋赤蘚死亡現象，隨時間的延續，樣本的死亡率顯著上升，第7天的存活率至較低水平。汞濃度為0～20 mmol·L-1時，齒肋赤蘚7 d培養后存活率達到95%以上；汞濃度達到30 mmol·L-1時，齒肋赤蘚于第6天出現死亡現象，7 d培養后存活率達到88%；而其他濃度的齒肋赤蘚活性第5天出現死亡現象，且7 d培養后存活率均低于40%。綜上可知，汞濃度是影響齒肋赤蘚生物結皮活性最主要的因素，同時濃度及時間產生共同影響。

圖1 重金屬Hg脅迫下齒肋赤蘚生物結皮存活率隨時間的變化Fig. 1 The survival rate of Syntrichia caninervis under the Hg stress

2.2 對齒肋赤蘚生物結皮細胞器超微結構的毒害效應

2.2.1 對齒肋赤蘚生物結皮細胞壁的影響

不同濃度汞對齒肋赤蘚生物結皮葉肉的細胞壁影響如圖2所示。齒肋赤蘚生物結皮在0～10 mmol·L-1濃度下，細胞壁結構完整，相鄰細胞壁有明顯的界限，細胞膜和原生質層清晰可見；汞濃度為20 mmol·L-1時，細胞壁開始發生質壁分離現象，出現一定的褶皺現象，但依然觀察到完整的細胞壁及原生質體；當汞濃度達到30 mmol·L-1時，細胞壁逐漸變得模糊，出現輕微質壁分離現象，伴有一定的扭曲；汞濃度≥40 mmol·L-1時，質壁分離較明顯，細胞壁兩側的液泡出現空泡化現象，細胞壁由清晰變得模糊再到顏色加深變黑。隨汞濃度的持續增加，最終導致細胞壁兩側細胞質的空泡化。

圖2 不同Hg濃度下齒肋赤蘚生物結皮細胞壁、葉綠體和細胞核的變化注： A. 0和10 mmol·L-1汞濃度下，細胞器超微結構正常，未發生變化；B. 20 mmol·L-1汞濃度下，細胞器出現輕微損傷；C. 30 mmol·L-1汞濃度下，細胞器已出現一定程度的毒害損傷；D. 40 mmol·L-1汞濃度下，細胞質壁分離現象加劇；E. 50和60 mmol·L-1汞濃度下，質壁分離現象明顯，細胞器模糊；F. 40 mmol·L-1汞濃度下，葉綠體損傷程度加劇，空泡化現象加劇；G. 50和60 mmol·L-1汞濃度下，葉綠體空泡化嚴重甚至出現葉綠體解體現象；H. 40 mmol·L-1汞濃度下，細胞核損傷程度加劇，空泡化現象加劇；L. 50和60 mmol·L-1汞濃度下，細胞核嚴重空泡化甚至完全解體，細胞質出現外溢的現象。M表示線粒體，CB表示細胞壁，Chl表示葉綠體，c表示圓形顆粒，N表示細胞核，CY表示細胞膜。Fig. 2 Changes of the cell wall, chloroplasts and nuclei of Syntrichia caninervis at different concentrations of HgNote: Fig.A. 0 and 10 mmol·L-1 Hg, the normal physiological state of cell structures; Fig.B. 20 mmol·L-1 Hg, the slight changes of cell structures than the normal; Fig.C. 30 mmol·L-1 Hg, the observed damage of cell structures than the normal; Fig.D. 40 mmol·L-1 Hg, cytoplasmic wall separation was intensified; Fig.E. 50 and 60 mmol·L-1 Hg, cytoplasmic wall separation was more significant, and the cell structure was fuzzy; Fig. F. 40 mmol·L-1 Hg, the degree of chloroplast damage was aggravated, and the vacuolization was aggravated; Fig.G. 50 and 60 mmol·L-1 Hg, the vacuolization of chloroplast was serious and even the disintegration of chloroplasts occurred; Fig.H. 40 mmol·L-1 Hg, the degree of nuclei damage was aggravated, and the vacuolization was aggravated; Fig.L. 50 and 60 mmol·L-1 Hg, the vacuolization of the nuclei was serious or the nuclei was even completely disintegrated, resulting in cytoplasm overflow. M stands for mitochondrial; CB stands for cytoderm; Chl stands for chloroplast; c stands for round granas; N stands for the nucleus; CY stands for cell membrane.

2.2.2 對齒肋赤蘚生物結皮葉綠體的影響

不同濃度汞對齒肋赤蘚生物結皮葉肉細胞葉綠體的影響如圖2所示。在0 mmol·L-1汞濃度下，細胞葉綠體形態清晰，呈狹長的梭狀，葉綠體膜結構完整，基質均勻，類囊體片層結構有規律地排列，內部附少量的淀粉粒；在10 mmol·L-1濃度時，細胞葉綠體結構仍趨完整，未發生變化，清楚觀察到完整的基粒及基質片層結構，葉綠體僅輕微腫脹；汞濃度達到20 mmol·L-1，葉綠體持續腫脹，淀粉顆粒消失，基粒與基質片層也相應減少，基質片層輕微降解及扭曲模糊，雙層膜結構輕微損傷；在30 mmol·L-1濃度下，葉綠體腫脹明顯，葉綠體明顯空泡化，基粒與基質片層模糊，葉綠體周圍細胞器解體；40 mmol·L-1濃度時，葉綠體空泡化加劇、嚴重腫脹，葉綠體膜出現褶皺變形及內外模糊嚴重；當汞濃度≥50 mmol·L-1，葉綠體空泡化嚴重至解體，被膜結構模糊而消失，葉綠體內物質出現外溢，類囊體、基質和基粒片層結構消失。

2.2.3 對齒肋赤蘚生物結皮細胞核的影響

不同汞濃度對齒肋赤蘚生物結皮葉肉細胞核的影響如圖2所示。在0 mmol·L-1汞濃度下，可清晰觀察到細胞核結構及核膜；10 mmol·L-1汞濃度下，細胞核整體僅微小變化，仍為完整的細胞核；當汞濃度為20 mmol·L-1時，細胞核萎縮，核膜開始出現模糊現象；30 mmol·L-1濃度時，細胞核嚴重模糊，有一定解體現象出現；40 mmol·L-1濃度下，細胞內各細胞器呈模糊化，大部分細胞器出現空泡化；當汞濃度≥50 mmol·L-1時，細胞核嚴重空泡化甚至完全解體，細胞質出現外溢現象。

3 討論(Discussion)

植物長期生長在重金屬環境中，重金屬離子進入細胞，影響細胞組織代謝活動的多個細胞器，干擾細胞正常的物質合成，造成直接的毒害效應[21]。實驗結果表明，受20 mmol·L-1汞脅迫時，齒肋赤蘚生物結皮的葉肉細胞器清晰可見，結構完整，未見明顯損傷，表明齒肋赤蘚生物結皮有弱耐汞性。隨著汞濃度和脅迫時間的增加，齒肋赤蘚生物結皮細胞器受破壞程度增加，這與維管束植物葉片受重金屬毒害效應的結果相似，且與非維管束植物受其他脅迫(干旱和鹽)時葉肉細胞器的變化相似。

齒肋赤蘚生物結皮葉肉細胞器是與外界物質交換、運輸的重要組織，外界脅迫會導致細胞器(細胞壁、葉綠體和細胞核)損傷。細胞壁是重金屬離子進入細胞內的第一道屏障，能夠沉淀、抵御重金屬離子進入細胞或富集在細胞壁外部，直接削弱重金屬影響細胞的代謝活動[22-23]。進入葉肉細胞內的重金屬離子，對光合作用場所——葉綠體產生影響，類囊體可維系膜電荷穩定，傳遞光能和維持光合系統正常功能。受毒害的類囊體會降低及擾亂植物對光量子的吸收傳遞和轉化，削弱光合作用[24]。嗜鋨顆粒是評價植物葉肉細胞受損害的指標之一，葉綠體內嗜鋨顆粒的增多，表征細胞合成較多的脂類物質，對膜結構完整性及正常代謝活動起到保護作用[25]，這也是對脅迫響應的反饋。將齒肋赤蘚生物結皮葉肉細胞超微結構變化和存活率的結果綜合分析，發現齒肋赤蘚生物結皮葉肉細胞在低濃度(≤20 mmol·L-1)時未受傷害，可能是齒肋赤蘚生物結皮有較厚的細胞壁，將重金屬部分離子阻隔在細胞壁外，或富集在細胞壁上，降低重金屬離子進入細胞質的量，減弱細胞器的損傷。隨著濃度增加，細胞壁被損壞，失去保護作用，葉綠體明顯腫脹，空泡化嚴重，葉綠體膜出現褶皺變形，基粒與基質片層模糊，嗜鋨顆粒增多變大，細胞核解體及核仁消失，最終整個細胞器完全破損。這與前人對植物葉肉細胞器超微結構的觀測是一致的[6,26]。

在低汞濃度(≤20 mmol·L-1)下，齒肋赤蘚生物結皮葉肉細胞無顯著性變化，汞濃度為30 mmol·L-1時，葉肉細胞器逐漸受脅迫傷害，且存活率與低濃度時比較有顯著性差異，可以推測20 mmol·L-1是齒肋赤蘚生物結皮受汞脅迫的閾值。當汞濃度較低時，葉肉細胞器會限制重金屬離子進入細胞，或將其富集在細胞壁外，這與Gao等[6]得出的細胞壁的阻隔作用可維護細胞器結構的完整性的結論一致。倪才英[26]發現銅脅迫下海州香薷(E.splendens)和紫云英(A.sinicus)的細胞壁出現裂隙模糊等損傷，這與本研究中觀察到的現象相似。但是齒肋赤蘚生物結皮是非維管束植物，不同類型的植物損傷機理是否一致，仍需進一步深入研究。當汞濃度≥50 mmol·L-1時，富集在細胞壁中重金屬離子濃度超過閾值，致使質壁分離現象明顯，葉綠體膨脹嚴重，膜結構完全破裂，類囊體、基粒及基質片層結構完全消失，細胞核解體及核仁消失，這與前人的研究結果一致[27-30]。這由于突破了細胞壁對重金屬離子阻隔及富集的有限作用，重金屬離子直接傷害葉肉細胞器，使組織代謝功能消失而致其死亡。已有研究表明，重金屬抑制了葉綠素合成相關酶的活性，引起細胞過氧化，造成膜結構損傷[31-32]。本實驗觀察到的葉綠體內嗜鋨顆粒增多，也是細胞過氧化的現象，因沒有涉及細胞酶活性的考察，所以只能通過膜結構的損傷來進行對比，結果仍具有一定的相似性。另有研究表明，重金屬脅迫會影響葉綠素的合成[33]，降低類囊體膜上電子傳遞和希爾反應活性，抑制光合作用[34-35]。本實驗觀察到類囊體膜的損傷和隨后消失，是其內部生理代謝活性轉變的過程，具體機制的確定還需借助其他技術手段進一步研究。葉肉細胞內葉綠體在重金屬脅迫下，由細胞邊緣位置向細胞中央移動，這可能是細胞的內含物或其他細胞器受到傷害，產生形態變形或位置于細胞內發生偏移，還可能因為細胞內滲透壓大小不均衡使葉綠體發生了位移[32,36-43]，這還有待進一步確定。

完整的細胞器結構是維系細胞功能的保障，重金屬對植物細胞超微結構的傷害不僅是破壞某個或幾個細胞器，而是對細胞內膜結構及非膜結構系統的復合傷害。植物的毒害效應是診斷重金屬污染的重要依據[39]。不少學者提出，重金屬濃度不同對植物細胞造成的毒害效應有所差異[40]，本研究結果也顯示，重金屬對細胞超微結構的毒害效應與離子濃度密切關聯。細胞器通過減少重金屬離子的跨質膜運輸，降低原生質體中重金屬離子濃度，維持細胞的正常生理代謝[41],當遭受高濃度重金屬脅迫時，細胞質膜容納重金屬離子的功能損壞，細胞膜受損[42]，膜結構和流動性改變[43]。植物通過長期的適應和演化，可進化出抵抗重金屬毒害的機制，形成解毒過量的痕量元素的精細體系[44]。

齒肋赤蘚生物結皮是所研究荒漠系統中重要的優勢群落，本研究從葉肉細胞超微結構層面揭示了齒肋赤蘚對重金屬汞的細胞生物學抗性機制，確定了20 mmol·L-1的耐受性閾值；隨著汞濃度和培養時間的增加，齒肋赤蘚生物結皮的存活率可反映葉肉細胞器的毒害程度；不同濃度的汞對齒肋赤蘚生物結皮葉肉細胞器的毒害效應、致死率具有差異性。同時，還需從生理生態等視角分析齒肋赤蘚生物結皮對汞的耐受性原理和機制。

致謝：本研究受新疆大學綠洲與生態重點實驗室、國家自然科學基金項目(31260112)和新疆聯合基金項目(2017D01C058)資助。