補(bǔ)陽還五湯輔助鼠源MSCs移植治療SD大鼠脊髓損傷的研究

王璐瑤 朱佳文 張文遠(yuǎn) 王天樞

摘 要 目的： 探討大鼠脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）后神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells， MSCs）移植與補(bǔ)陽還五湯（Buyang Huanwu decoction， BYHWD）對(duì)大鼠脊髓全橫斷損傷的修復(fù)。方法：對(duì)脊髓損傷的大鼠分別進(jìn)行鼠源MSCs移植或補(bǔ)陽還五湯治療及兩者聯(lián)合治療，觀察治療后大鼠行為學(xué)變化；檢測各組細(xì)胞wnt3a與β-actin比值。結(jié)果：t檢驗(yàn)分析表明，MSCs+BYHWD組大鼠的BBB評(píng)分值高于脊髓損傷組[（17.77±0.97） vs （15.33±1.02），P<0.05]；Western-Blot結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，MSCs組、BYHWD組及MSCs+BYHWD組的wnt3a表達(dá)上調(diào)，且MSCs+BYHWD組遠(yuǎn)高于MSCs組和BYHWD組。結(jié)論：補(bǔ)陽還五湯輔助MSCs移植治療SD大鼠脊髓損傷有一定改善效果，且改善效果遠(yuǎn)高于MSCs或BYHWD單藥治療。

關(guān)鍵詞 MSC 脊髓損傷 SD大鼠 補(bǔ)陽還五湯

中圖分類號(hào)：R289.5； Q813.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2020）23-0039-04

Study on the treatment of spinal cord injury in SD rats by Buyang Huanwu decoction-assisted rat-derived MSCs transplantation*

WANG Luyao**， ZHU Jiawen， ZHANG Wenyuan， WANG Tianshu***

（Department of Brain Surgery， the First Hospital affiliated to Jiamusi University， Heilongjiang Jiamusi 154002， China）

ABSTRACT Objective： To investigate the effect of neural stem cell （MSCs） transplantation and Buyang Huanwu decoction （BYHWD） on spinal cord injury （SCI） in rats. Methods： The rats with spinal cord injury were treated with rat-derived MSCs transplantation or Buyang Huanwu decoction and the combination of the two therapies. The behavioral changes of the rats were observed and the ratios of wnt3a to β-actin in each group of cells were detected. Results： The students t tests showed that the BBB score of the rats was higher in the MSCs + BYHWD group than the SCI group [（17.77±0.97） vs （15.33±1.02）， P<0.05]. Western-Blotting results showed that the expression of wnt3a in the MSCs group， BYHWD group and MSCs + BYHWD group was up-regulated as compared with the control group and furthermore its expression was much higher in the MSCs + BYHWD group than the MSCs group and BYHWD group. Conclusion： Buyang Huanwu decoction-assisted MSCs transplantation for the treatment of SCI in rats has certain improvement effect and its effect is much higher compared with MSCs and BYHWD monotherapy.

KEy WORDS MSC； spinal cord injury； SD rat； BYHWD

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）由機(jī)體中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷所致，其臨床癥狀主要表現(xiàn)在損傷處平面以下感覺、運(yùn)動(dòng)功能的完全或部分喪失，及大小便失禁等，常見脊柱脫位、骨折所致[1]。脊髓一旦發(fā)生損傷后，其損失往往呈不可逆性，患者受傷后自理能力下降或基本喪失，造成繁重的家庭和社會(huì)負(fù)擔(dān)。因此，尋找到可使脊髓神經(jīng)元再生、脊髓功能恢復(fù)的方法是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域目前最大的研究熱點(diǎn)之一。

近年來，再生醫(yī)學(xué)的迅猛發(fā)展，利用細(xì)胞移植修復(fù)來增加脊髓神經(jīng)細(xì)胞，并使得膠質(zhì)癖痕和空洞減少看到了曙光[2-3]。間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有多項(xiàng)分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控的特點(diǎn)[4]，是良好的細(xì)胞移植來源。另外中醫(yī)理論，“久臥傷氣”，脊髓損傷患者多見有氣虛血疲之證候，故應(yīng)以行氣血、通經(jīng)絡(luò)為治療方法。陽還五湯具有補(bǔ)氣活血、通經(jīng)活絡(luò)的功效，臨床中常用于中風(fēng)后遺癥、小兒麻痹后遺癥以及截癱或上、下肢瘓軟屬氣虛血癖者[5]。將中醫(yī)補(bǔ)陽還五湯與細(xì)胞移植治療相聯(lián)合，用于脊髓損傷治療，目前還未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從大鼠脊髓處獲取原代MSCs進(jìn)行培養(yǎng)用于治療大鼠脊髓損傷模型，并聯(lián)合補(bǔ)陽還五湯灌胃治療，對(duì)脊髓損傷的大鼠治療前后的行為學(xué)、分子水平檢測wnt3a及b-catenin蛋白表達(dá)情況進(jìn)行觀察，以此分析探究補(bǔ)陽還五湯輔助鼠源MSCs移植治療SD大鼠脊髓損的治療情況，以期為脊髓損傷的中西醫(yī)結(jié)合治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

4%水合氯醛（化學(xué)純，中國醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司）；DMSO、10 mmol/L PBS緩沖液（美國HyClone公司）；DMEM、F12、胎牛血清、EDTA、B27和胰蛋白酶（美國Gibco公司）；10 mg/ml 鏈霉素、100 U/ml 青霉素、a-MEM、2 mmol/L L-谷氨酰胺（美國Life Technologies公司）；膠原酶（瑞士Roche公司）；兔抗鼠wnt3a、b-actin一抗、山羊抗兔熒光二抗，CD（美國Sigma公司）；干細(xì)胞生長因子（以色列BI公司），CD45、CD105、CD73、CD90細(xì)胞流式檢測抗體（美國Biolegend公司）。

ST40離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司）；CytoFLEX流式細(xì)胞儀（美國貝克曼庫爾特公司）； CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher公司）；Power Pac 1645050基礎(chǔ)電泳儀、mini Protren Tetra 1658001蛋白垂直電泳槽（德國伯樂公司）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

選取雌性健康成年SD大鼠60只，體重220～250 g，將其隨機(jī)分為①正常對(duì)照組（Ctrl）；②脊髓損傷組（SCI）；③補(bǔ)陽還五湯灌胃組（BYHWD）；④MSCs移植治療組（MSCs）；⑤MSCs移植聯(lián)合補(bǔ)陽還五湯灌胃組（BYHWD+MSCs）；每組各12只。

1.2.2 原代MSCs的分離與培養(yǎng)

取SD大鼠，用4%水合氯醛麻醉，用75%體積分?jǐn)?shù)醫(yī)用酒精浸泡大鼠10 min。無菌條件下取出大鼠股骨及脛骨，用PBS清洗3次。剪掉股骨和脛骨的骨骺端，露出骨髓腔，用加入雙抗的L-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，反復(fù)進(jìn)行吹打；將沖出的骨髓制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min 離心5 min，棄上清，DMEM重懸以1×109/L的細(xì)胞濃度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。原代細(xì)胞接種48 h后更換全新完全培養(yǎng)基，在3～4 d時(shí)半量換液，7～9 d時(shí)即可傳代。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底，密度長至70%～80%融合時(shí)，胰酶消化，傳代培養(yǎng)（37 ℃，CO2飽和濕度培養(yǎng)環(huán)境）。

1.2.3 大鼠脊髓損傷后的行為學(xué)測試

脊髓損傷模型建立：用1 ml/100 g 水合氯醛溶液腹腔注射麻醉大鼠并將其固定。固定后找到大鼠腰2～3棘突，縱切一切口，暴露出皮下組織，用鈍性分器將棘突兩側(cè)肌肉及腰2～3棘突間韌帶剝離開來，暴露出脊髓，找到脊髓后再用22 G 腰麻針垂直扎入，注入0.5%布比卡因4 ml。

按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行大鼠行為測試，使用BBB評(píng)分法評(píng)分，觀察時(shí)間為5 min。注射效果及完整性以大鼠尾動(dòng)的情況來判斷。

1.2.4 Western-Blotting檢測wnt 3a蛋白表達(dá)情況

脊椎脫臼法處死每組實(shí)驗(yàn)大鼠，用手術(shù)剪剪掉股骨和脛骨的骨骺端，露出骨髓腔，PBS緩沖液洗清組織處血液，取大鼠脊髓組織，用剪刀剪碎收集組織置離心管中。1 000 r/min離心5 min，PBS清洗2次。按Solarbio公司總蛋白萃取試劑盒（total protein extraction kit）說明書進(jìn)行蛋白提取，BCA（bicinchonininc acid）法測定蛋白濃度。按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行加樣后，進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，結(jié)束后濕法轉(zhuǎn)膜，做好PVDF膜的標(biāo)記。轉(zhuǎn)膜完成后，封閉1 h，一抗（1∶1 000稀釋）4 ℃過夜孵育。第二天，室溫平衡1 h，TBST清洗膜3次，每次5 min。二抗（1∶10 000稀釋）室溫孵育2 h，TBST清洗二抗，5 min/次，共3次。最后使用化學(xué)發(fā)光法檢測wnt3a蛋白成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)處理

2 結(jié)果

2.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞hAMSCs的形態(tài)和免疫表型

大鼠骨髓分離培養(yǎng)得到的MSCs，在顯微鏡放大10倍的光鏡下觀察，可見MSCs細(xì)胞形狀成梭形，狀態(tài)良好（圖1）。

對(duì)分離培養(yǎng)得到細(xì)胞進(jìn)行特異性抗體染色，染色后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測鑒定，結(jié)果顯示98%以上的細(xì)胞都為一致的陽性表達(dá)或陰性表達(dá)（圖2）。培養(yǎng)細(xì)胞不表達(dá)白細(xì)胞共同抗原CD45，表達(dá)CD105、CD90、CD73間充質(zhì)干細(xì)胞表面特性分子標(biāo)記。證明從小鼠脊髓處分離提取培養(yǎng)的細(xì)胞為MSCs，純度較高。

2.2 脊髓損傷后大鼠后肢BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分結(jié)果

按照實(shí)驗(yàn)分組對(duì)每組的大鼠后肢進(jìn)行BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分，觀察各治療組和治療對(duì)照組的BBB評(píng)分及運(yùn)動(dòng)功能改善情況。大鼠脊髓損傷后給與MSCs、BYHWD、BYHWD+MSCs治療后其BBB評(píng)分值都高于未治療的SCI組，但單MSCs與BYHWD治療其BBB評(píng)分值與SCI組相比不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而采取BYHWD輔助MSCs移植治療后大鼠脊髓受傷后的后肢BBB評(píng)分與SCI相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032 8），結(jié)果表示兩者聯(lián)合治療后對(duì)大鼠的運(yùn)動(dòng)功能有改善（表1）。

2.3 Western-Blotting檢測wnt3a蛋白表達(dá)結(jié)果

提取每組蛋白進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，MSCs組，MSCs+BYHWD組，BYHWD組的wnt3a蛋白的表達(dá)與對(duì)照組（Ctrl）和SCI組相比較有明顯上調(diào)，且MSCs+BYHWD組wnt3a組蛋白的上調(diào)遠(yuǎn)高于MSCs、BYHWD組（圖3）。用MSC與BYHWD聯(lián)合治療脊髓損傷大鼠，wnt3a蛋白上調(diào)最為明顯，表明其治療效果最佳。

3 討論

Gao和Chen等[6-7]在膽堿能神經(jīng)元缺陷的大鼠模型上研究了神經(jīng)干細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷的潛能，結(jié)果顯示，由神經(jīng)干細(xì)胞分化的膽堿能神經(jīng)元的軸突能穿越腹側(cè)神經(jīng)根和坐骨神經(jīng)，并與外周肌肉組織形成功能性神經(jīng)—肌肉接頭。MSCs具有分化成神經(jīng)干細(xì)胞的潛能，MSCs移植治療大鼠脊髓損傷，其機(jī)制主要通過修復(fù)損傷軸突周圍的髓鞘，促進(jìn)軸突再生，并協(xié)助新血管的形成，幫助大鼠恢復(fù)一定功能[8-9]，細(xì)胞移植修復(fù)脊髓損傷有切實(shí)意義。

另外，出自我國清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》的補(bǔ)陽還五湯，現(xiàn)代研究表明其藥理作用極其廣泛，具有抗氧化、抗自由基損傷、改善血液流變學(xué)、改善微循環(huán)和調(diào)節(jié)免疫等作用[10-11]。雖然補(bǔ)陽還五湯治療脊髓損傷的機(jī)制尚不十分清楚，但有研究顯示，補(bǔ)陽還五湯可以改善損傷脊髓微循環(huán)，減少氧化損傷，抑制興奮性氨基酸的釋放，抑制細(xì)胞調(diào)亡，促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成，從而促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，可改善腦缺血大鼠長期感覺運(yùn)動(dòng)功能，減輕腦損傷[10， 12]。然而，現(xiàn)發(fā)表的文獻(xiàn)缺乏MSCs與中醫(yī)補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合作用的相關(guān)實(shí)驗(yàn)探究，對(duì)兩者治療方法結(jié)合后的治療效果未知，是一個(gè)新興的研究領(lǐng)域，研究意義深遠(yuǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠脊髓損傷模型，對(duì)脊髓損傷大鼠進(jìn)行MSCs體內(nèi)注射聯(lián)合灌胃補(bǔ)陽還五湯治療，與對(duì)照組結(jié)果相比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示聯(lián)合治療后BBB評(píng)分值、wnt3a蛋白的表達(dá)均高于MSCs體內(nèi)注射或補(bǔ)陽還五湯單方案治療。wnt3a的高表達(dá)可增加脊髓中有絲分裂的數(shù)目[13]。該實(shí)驗(yàn)從脊髓受損傷大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，wnt信號(hào)調(diào)控的分子水平上面綜合分析了兩者聯(lián)用的治療效果，大鼠損傷后聯(lián)用治療效果較優(yōu)，促進(jìn)大鼠恢復(fù)。但該模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)較簡單，所研究的層面較為粗淺，不能較為充分全面的解釋兩者聯(lián)合治療方式治療原理，該實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果僅僅為后續(xù)更深一步的探究補(bǔ)陽還五湯輔助鼠MSCs移植治療SD大鼠脊髓損傷技術(shù)提供了初淺的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，有待于更多基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于證明該治療方式。

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*基金項(xiàng)目：黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題（201810222058）

**作者簡介：王璐瑤，主治醫(yī)師。從事大鼠脊髓損傷模型研究。E-mail： 1766514920@qq.com

***通信作者：王天樞，主治醫(yī)師。從事脊柱外科研究