基于LAMP的微流控芯片病原體快速檢測方法研究進展

趙 陽，王 喆，賈舒麟，劉怡辰，趙佳琪，趙 臣*

(1.中國人民解放軍聯勤保障部隊第965醫院 傳染科，吉林 吉林132012；2.吉林醫藥學院 檢驗學院；3.北華大學 醫學技術學院)

急性傳染病具有傳播速度快、傳播范圍廣、不易控制等特點，嚴重威脅著廣大人民群眾的生命安全，其快速檢測、早期診斷尤為重要。環介導等溫擴增技術(LAMP)是新型的基因擴增技術，可在恒溫環境下快速、靈敏、高效、特異地進行基因擴增，具有特異性強、靈敏度高、檢測耗時短、操作簡便等優點。目前，LAMP技術與微小可控、功能集成的微流控芯片技術相結合，發展出一種快速、準確的，適用于即時檢測的新型基因分析技術。它簡化了基因檢測過程中繁瑣的樣品處理和擴增產物的檢測步驟，適用于在采樣現場進行的、利用便攜式分析儀器及配套試劑進行的現場快速檢測(POCT)[1]，被廣泛應用于醫療[2]、農牧業[3]、檢驗檢疫[4]和刑事偵查[5]等領域中。本文就基于LAMP的微流控芯片快速檢測技術在傳染病病原體檢測中的應用研究作一綜述。

1 環介導等溫擴增技術(LAMP)

LAMP是由日本學者Notomi等[6]提出的一種新型等溫基因擴增方法。該技術對基因的擴增分為兩個階段。第一階段為啟動階段，是莖環形成的階段。雙鏈DNA模板在等溫(60-65℃)的條件下通過一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)并依賴于4-6條特異性引物產生一條兩端成環的單鏈DNA，形成莖環狀結構[7]，該結構是第二階段基因擴增的起始結構。第二階段是循環擴增階段，以莖環結構為模板，進行DNA合成延伸以及鏈置換，最后產物為含有若干倍莖長度的莖環DNA混合物[8]。擴增過程中產生的焦磷酸與Mg2+反應產生焦磷酸鎂沉淀[9]，可作為擴增結果的觀察依據。

1.1 LAMP技術高特異性、高靈敏性LAMP技術使用1對外部引物和1對內部引物等2對特異性引物，可以識別目的基因序列上6個不同的區域，對目的基因序列具有高度的選擇性，減少了非靶標序列的影響，因此擴增的特異性非常高。Aryan等[10]選擇重復插入IS6110序列建立了LAMP檢測MTB復合群方法，靈敏度比通常的PCR方法提高了20倍。LAMP對目的基因序列具有高度的選擇性，減少了非靶標序列的影響，具有非常高的特異性。

1.2 LAMP技術步驟簡單、效率高、成本低LAMP技術可以在等溫條件下實現擴增，不需要進行模板的預變性，減少了PCR 技術升降溫帶來的影響以及對昂貴、精密實驗儀器的要求，具有顯著的高效性，可以在60 min內把拷貝的目的基因迅速擴增到109拷貝[6]。相較于PCR復雜的升降溫技術和依賴核酸序列擴增技術[11]繁多的擴增步驟和反應體系，LAMP無需進行模板預變即可實現等溫擴增，免去了對昂貴、精密實驗儀器的要求，而且更易于搭載微流控芯片。

1.3 LAMP擴增結果觀察便捷、精確LAMP陽性擴增反應中會產生大量白色焦磷酸鎂沉淀，可利用濁度儀、凝膠電泳、直接肉眼觀察或根據顏色變化進行檢測，擴增反應結束即可直接肉眼觀察反應結果，或根據試劑顏色變化判斷是否發生反應。此外，病原體檢測只需對樣本進行簡單處理，省略了繁瑣的基因提取步驟，更適用于病原體POCT快速檢測。

2 微流控芯片技術

20世紀90年代初，A.Manz等[12]首次提出了微流控芯片的概念，是將生命科學應用分析的樣品制備、反應、分離、檢測等基本操作單元，集成到一塊微米尺度芯片上的微型化整合技術，實現操作、檢測一體化，只需微量的樣品與檢測試劑，即可實現幾分鐘甚至更短時間內上百個樣品的平行自動分析[13,14]。隨著微流控芯片技術的不斷發展，目前已經誕生了數字微流控芯片、蝶式微流控芯片、卡式微流控芯片、電泳分析微流控芯片、HDA微流控芯片、POC微流控芯片等多種微流控芯片[15-17]。

微流控芯片技術具有液體流動可控性、低成本、耗樣量少、高效檢測的高度集成微型化等特點，還可避免因傳統方法功能局限而帶來的損失與污染。早在2010年，Cheng等[18,19]首次利用紙基微流控芯片檢測人類免疫缺陷病毒和T7噬菌體，結果表明該技術比傳統ELISA法和PCR法更快、更經濟。

3 基于LAMP的微流控芯片在急性傳染病病原體快速檢測中的應用

急性傳染病病原體檢測關系到疾病的流行病學分析和早期防控等多方面問題。目前的病原體檢查方法已經從傳統的免疫學方法過渡到了分子生物學方法，基于LAMP的微流控芯片技術準確度高、操作簡單、反應快速、反應結果易于觀察，尤其適用于突發疫情的POCT監測，在急性傳染病的防控中可以發揮十分重要的作用。

3.1 在甲型H1N1流感病毒檢測中的應用張永樂等[20]利用LAMP技術成功檢測甲型H1N1流感病毒，在將H1N1質粒進行10倍稀釋后LAMP法仍能檢出，靈敏度、特異性良好。孔文[21]等現場采集70份鼻咽拭子標本，整合環介導等溫擴增技術和微流控芯片技術，建立了微流控實時熒光逆轉錄環介導等溫擴增快速檢測甲型H1N1流感病毒方法，能在恒定溫度(65℃)30 min內完成擴增反應，檢測限度可達10 copies/μL。經對多種流感病毒基因提取物進行檢測，結果僅甲型 H1N1流感病毒產生擴增曲線，且將待測物模板梯度稀釋后發現，反應靈敏度可達10 copies/μL，表明該方法可高特異性、高靈敏度地檢測H1N1流感病毒。王瑞麗[22]建立的微流控LAMP方法并成功應用于甲型H1N1流感等流感病毒的檢測，其檢測限為10-100 fg/反應，整個反應過程在30 min內完成，提高了對流感疫情的監測能力，為患者就醫爭取了寶貴的時間。

3.2 在人類免疫缺陷病毒(HIV)檢測中的應用郭宏雄[23]等成功建立HIV的LAMP檢測方法，靈敏度檢測結果顯示該方法可檢測出10 copies/μL的病毒樣品；特異性檢測顯示在多種病毒模板中只能擴增HIV-1樣品，不會出現假陽性；臨床樣品檢測結果顯示該方法檢測陽性符合率可達84.3%以上，對主要流行HIV亞型均有較好的檢測效果。蔣興宇等[24]利用一種新型的微流控免疫檢測方法成功提高了HIV的檢測效率，實現了P24、P41、P120等抗原與多個血清樣品的免疫反應的同時檢測，將至少4個小時的檢測縮短至10分鐘內，且結果與傳統ELISA法符合率100%。Chen等[25]將LAMP與微流控芯片技術結合，成功實現HIV RNA的CARD芯片提取和RT-LAMP檢測，檢測過程大約20 min即可完成，分析靈敏度在每毫升103病毒顆粒(103vp/mL)范圍內，卡式微流控環介導等溫擴增技術可成功實現HIV檢測。

3.3 在乙型肝炎病毒(HBV)檢測中的應用邵靚婧等[26]成功利用LAMP技術進行乙型肝炎的快速檢測，采用羥基萘酚藍作為顯色劑建立HBV的可視化 LAMP 反應體系，在1 h內敏感、特異地檢測出血清中的HBV，檢測低限為10 copies/μL。王可可[27]等成功利用微流控熒光定量PCR技術實現HBV的快速檢測，擴增結果通過實時計算確定其Ct值在37左右，檢測結果呈HBV弱陽性，成功檢測出血液樣本中的微量HBV。郅曉[28]將LAMP技術集成在微流控芯片中，成功實現HBV基因分型檢測，在63℃的恒溫反應1 h，然后進行瓊脂糖凝膠電泳。當微流控芯片微通道中發生 LAMP反應的時候，微流控芯片上標記有探針的同一區域會在注入磁性納米團簇之前和之后分別被GMR傳感器電阻檢出，電阻變化值顯示陰、陽性信號明顯。檢測系統的靈敏度高達10 copies/mL，檢測范圍為10-109copies/mL。

3.4 在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)檢測中的應用2015年管瀟[29]等已成功運用一種基于LAMP的集細菌在線裂解、核酸提取、目標基因擴增和產物檢測一體化的集成式微流控芯片實現對MRSA的在線檢測。以MRSA的mecA基因為靶基因，完成101-106cfu的在線裂解、LAMP擴增和產物測定。1 h內即可實現對MRSA mecA基因的快速檢測，反應后將該將芯片置于自然光下，觀察LAMP反應腔顏色，陰性對照顯示為橙色不變，陽性對照和106cfu/μL樣本顯示為綠色。此外，Huang[30]等設計的蝶式空氣絕緣微流控LAMP芯片可以檢測低至10 copies/μL，經229例肺炎支原體、MRSA和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的病人痰標本雙盲實驗，顯示該檢測系統與傳統RT-PCR的符合率可達99.56%。

3.5 在腦膜炎奈瑟球菌檢測中的應用李海清等[31]成功利用LAMP技術實現對腦膜炎奈瑟球菌的快速檢測，靈敏度實驗顯示LAMP擴增最低可達10fg，是PCR擴增體系最低檢測限度的10倍。Dou等[32]將自主研發的微流控LAMP PDMS/紙混合技術成功實現對腦膜炎奈瑟球菌的檢測，可同時檢測三種待檢樣品，檢測靈敏度高，最低檢出限為3個拷貝，是目前有報道的將LAMP檢測系統用于病原體檢測的最低檢出限。該裝置使用色譜紙作為底物，反應產物可與底物結合發生顏色變化，靈敏度高，適合基層醫療機構POCT實時床旁診斷。

3.6 在結核分枝桿菌檢測中的應用劉毅等[33]成功利用LAMP技術檢測肺結核患者痰標本中結核分枝桿菌，檢出限為120 cfu/mL，檢測特異性、敏感性均為100%。陶峰等[34]聯合LAMP技術與結核分枝桿菌快速培養實現對涂陰肺結核診斷，較傳統涂陰肺結核陽性檢出率40%相比，LAMP檢測敏感性為81.3%，特異性78.6%，均高于傳統方法診斷，對于肺結核桿菌的診斷與防治具有重要意義。方雪恩[35]結合LAMP和微流控技術建立單重、多重微流控集成芯片，可用于床邊細菌性病原體一次性快速診斷。該技術整合了基因提取、擴增和信號檢測技術，僅需約10 μl的原始樣品，就可以在45-60 min內直接通過肉眼快速判定被檢樣品中是否含有肺結核桿菌。

4 結語

將基于LAMP的微流控芯片檢測技術應用于傳染病病原體檢測是當前核酸擴增領域的一個熱點課題，LAMP技術與微流控芯片技術相結合也是今后發展的一個必然趨勢。同時基于LAMP的微流控芯片檢測體系可以廣泛用于細菌性病原體的床邊POCT快速檢測分型，對于某些重大疾病的防控具有十分重要的意義。