長鏈非編碼RNA GAS5及高通量分析在大隱靜脈曲張診療中應用

李 磊，曹忠文

(吉林省前衛醫院 血管外科，吉林 長春130012)

大隱靜脈曲張是一種較為常見的血管外科疾病，患者多以下肢腫脹和疼痛為主訴,若不及時治療會導致血液在曲張的靜脈內瘀滯從而形成血栓，并會引起肺動脈栓塞進而導致嚴重后果[1]。嚴重的大隱靜脈曲張診療較為容易，通過患肢站立時視診及血管彩超均可診斷。但如何在曲張早期尚未引起嚴重并發癥時進行診斷目前仍有困難。近年來非編碼RNA在病變組織和健康組織中存在差異性表達使其成為了研究熱點，并且這些非編碼RNA在機體內廣泛存在且在疾病發展的早期階段即呈現差異性表達，使其有望成為各種疾病早期診斷的新的血清學標志物及治療的靶點[2]。而長鏈非編碼RNA GAS5已經被證實在癌癥及血管病變中參與疾病的發生和發展[3,4]，但其是否能夠在大隱靜脈曲張的早期診斷及治療中發揮作用目前尚不明確。故本文通過驗證大隱靜脈組織中GAS5差異性表達并進行高通量生物信息學分析來明確GAS5對大隱靜脈曲張中的診斷及治療價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2016年1月—2018年6月就診于吉林省前衛醫院血管外科的大隱靜脈曲張患者49例。全部患者均行大隱靜脈剝離手術治療，并經病理學組織檢查確診為大隱靜脈曲張。排除標準：①繼發性靜脈曲張。②既往有深靜脈血栓形成、淺表血栓性靜脈炎、血栓后綜合征、Klippel-Trenaunay綜合征、May-Thurner綜合征或任何其他靜脈疾病病史。其中男20例，女29例，平均年齡54.1±9.2歲。對照組為正常的大隱靜脈患者50例，其中男26例，女24例，平均年齡57.6±9.1歲。組織取自冠狀動脈旁路移植手術后剩余的大隱靜脈。入組病例一般基本資料詳見表1。本實驗經吉林省前衛醫院倫理委員會審核并批準，全部患者同意將手術切取的大隱靜脈作為科研使用，并在手術前簽署本項目知情同意書。

表1 3組患者一般資料比較

*P<0.05；表中數據以均數±標準差或例(%)表示

1.2 高通量分析長鏈非編碼RNA芯片表達結果GSE51260來源于GEO數據庫(GEO,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。選取其中5例病變組織和5例正常組織。通過GEO2R軟件進行差異表達基因分析。差異表達篩選標準為(差異倍數在2倍以上及P<0.05)。Graphpad prism 7進行差異基因的火山圖繪制。利于miRDB (www.mirdb.org) and TargetScan (www.targetscan.org)[5]高通量數據篩選工具進行靶基因及相關的結合基因進行預測。Cytoscape軟件進行共表達網絡圖繪制。

1.3全部患者標本均為術中手術切取獲得。RNA提取采用TIANDZ(天恩澤)試劑盒。NanoDrop2000 超微量分光光度進行RNA濃度及純度的檢測，純度OD260/OD280選擇在1.8-2.0之間的RNA。RNA逆轉錄為cDNA采用All In One cDNA逆轉錄試劑盒，逆轉錄過程嚴格按照All In One cDNA試劑盒說明書進行，逆轉錄所用RNA量為1 μl，總反應體系13 μl。反應條件為60℃10 min，4℃5 min。逆轉錄的cDNA放在冰中保存并進行下一步反應。

1.4 實時定量PCR操作儀器為ABI公司生產的7500 Real time PCR機器，采用ABI公司生產的配套96孔PCR板， 反應體系為20 μl，采用All In One PCR試劑盒。因為根據Primer-primer設計并由華大基因公司設計，具體序列見表2，反應條件為:95 ℃ 10 min;95 ℃15 s， 60 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，40 cycles；95℃15s，60℃ 1 min，95℃15 s。每組樣品均設3 個重復。

表2 熒光定量引物表

2 結果

2.1芯片結果顯示總共對27126個基因進行檢測，其中24938個基因無明顯變化，745個上調差異性表達的基因，1443個下調差異性表達的基因。對上述數據進行火山圖差異表達基因繪制，顯示如圖1。

2.2在49例大隱靜脈曲張患者組織標本中，長鏈非編碼RNAGAS5 均在組織中表達，診斷陽性率達100%。RT-PCR檢測結果發現 GAS5在病變組(4.37±0.14)和對照組(5.62±0.31)之間呈現差異性低表達，差異有統計學意義(P<0.05)(圖2)。

2.3GENE數據庫(GENE,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)顯示GAS5的堿基序列為1 gtcttttcga ggtaggagtc gactcctgtg aggtatggtg ctgggtgcag atgcagtgtg 61 gctctggata gcaccttatg gacagttgtg tccccaagga aggatgagaa tagctactga121 agtcctaaag agcaagccta actcaagcca ttggcacaca ggcattagac agaaagctgg 181 aagttgaaat ggtggagtcc aacttgcctg gaccagctta atggttctgc tcctggtaac 241 gtttttatcc atggatgact tgcttgggta aggacatgaa gacagttcct gtcatacctt 301 ttaaaggtat ggagagtcgg cttgactaca ctgtgtggag caagttttaa agaagcaaag 361 gactcagaat tcatgattga agaaatgcag gcagacctgt tatcctaaac tagggttttt 421 aatgaccaca acaagcaagc atgcagctta ctgcttgaaa gggtcttgcc tcacccaagc 481 tagagtgcag tggcctttga agcttactac agcctcaaac ttctgggctc aagtgatcct 541 cagcctccca gtggtctttg tagactgcct gatggagtct catggcacaa gaagattaaa 601 acagtgtctc caattttaat aaatttttgc aatccatcaa aaaaaaaaaa aaaaaa。miRDB (www.mirdb.org)對GAS5可能結合的miRNA進行預測提示6種miRNA分別為hsa-miR-548aw(score 83)，hsa-miR-1261(score 62)，hsa-miR-6888-3p(score 60)，hsa-miR-4673(score 55)，hsa-miR-4645-5p(score 55)，hsa-miR-1304-5p (score 55)。TargetScan (www.targetscan.org)對上述6個miRNA進行靶基因的預測，ESR1，BMPR2，PPP1R15B，KBTBD8，RIMS2，PLXNA4；GSG1L，NRXN1，KCNK12，ZCWPW2，NAIP，INSIG1；CREB3L3，ZFAND1，ADGRF5，ABHD10，PDAP1，SOX14；FGFRL1，UBFD1，SH3PXD2B，SMAD4，KCTD6，WWTR1；NPHP3，FBXO45，CAPRIN2，TET3，OCSTAMP，ENTPD1；ANXA2，NXPH1，GCC1，SLC35B4，ACTR1A，VTA1。選取預測分數校高的基因進行共表達網絡圖繪制，如圖3。

圖1 大隱靜脈曲張組織與正常組織差異表達基因火山圖

圖2 RT-PCR檢測GAS5在病變及正常大隱靜脈組織的表達量

圖3 共表達網絡圖繪制預測GAS5的相關通路

3 討論

大隱靜脈曲張是下肢血管疾病中較為常見的一種。其好發于30-70歲之間，女性患者較為多見。目前大隱靜脈曲張的具體發病機制尚不清楚，普遍認為和血管壁先天發育異常和血管內壓力過高相關。而對于有靜脈曲張家族史患者和長久站立的人更容易誘發大隱靜脈曲張。患者以站立時靜脈曲張為主要臨床表現并伴有下肢疼痛腫脹和營養障礙為主。此疾病目前診斷較為容易，但是一般等到疾病發展到較容易診斷時已經到了終末期大隱靜脈曲張。如何能在早期對此類疾病進行診斷，進而通過對危險因素的干預來起到延緩大隱靜脈曲張的發生目前仍未有報道。

近年來，長鏈非編碼RNA[6]逐漸被發現在疾病的發生發展中起到重要的調控作用。而對于具有遺傳傾向的疾病中，其在疾病尚處于發展過程中即呈現差異性表達。故有報導指出其可作為一種新的血清標志物對疾病進行早期診斷。這種長度大于200個核苷酸的不具備編碼功能的RNA，在體內表達較為豐富，廣泛存在于體液如唾液、血液、尿液中，使得臨床檢驗較為方便和簡單。故本文通過對既往數據庫大量信息的挖掘和分析并根據文獻報道，欲驗證長鏈非編碼RNA GAS5對大隱靜脈曲張的診斷價值，并通過高通量信息分析手段預測其可能的調控機制。

我們對數量高達27126個長鏈非編碼基因進行檢測，發現其中有745個上調差異性表達和1443個下調差異性表達的基因。這些基因的差異表達倍數均較正常組織超過2倍，最高差異表達倍數為5.54倍，提示上述差異表達的基因可能都參與大隱靜脈曲張的表達。而據文獻報道，GAS5參與干細胞的自我更新[7]、膀胱細胞的壞死調控[8]、前列腺癌細胞[9]的增殖和凋亡等。其中有報道稱其可通過TGF-β信號通路參與調節平滑肌細胞的增殖過程[10]。而大隱靜脈血管壁中也主要由平滑肌細胞組成，故本文長鏈非編碼芯片分析結果提示GAS5可能通過對靜脈血管平滑肌細胞的調節進而引起血管壁薄弱而導致靜脈曲張。為進一步驗證上述說法，我們首先對49例大隱靜脈曲張組織進行GAS5基因的檢測，發現GAS5基因在全部病變組織中呈現差異性低表達，陽性率可達100%。隨后我們對GAS5基因進行高通量分析，首先我們通過miRDB軟件發現其可能通過“分子海綿”作用微小RNA進而發揮調控機制，其可能吸附hsa-miR-548aw,hsa-miR-1261,hsa-miR-6888-3p,hsa-miR-4673,hsa-miR-4645-5p,hsa-miR-1304-5p這6種微小RNA進行對血管平滑肌細胞通路的調控，這與既往報道結果相似。而進一步通過TargetScan對上述6個miRNA的靶基因進行預測我們發現，Annexin A2(ANXA2)是hsa-miR-4673調控的靶基因。而ANXA2既往報道參與到血管平滑肌細胞的增殖和凋亡的調控中[4]。故GAS5可能通過對hsa-miR-4673吸附作用進而影響ANXA2導致血管平滑肌細胞凋亡最終引起血管壁的薄弱導致靜脈曲張。

總之，通過對大樣本的驗證發現GAS5在大隱靜脈曲張組織中呈現差異性低表達提示GAS5可能作為診斷大隱靜脈曲張的一種潛在血清標志物。而高通量分析也高度提示GAS5通過hsa-miR-4673調控ANXA2進而影響血管平滑肌細胞的增殖，也說明檢測GAS5對大隱靜脈曲張患者特別是曲張早期的患者具有診斷價值。